第一章：鼻咽癌细胞株CNE-2Z中肿瘤干细胞样细胞的悬浮培养和鉴定目的：探讨富集鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞的方法并鉴定鼻咽癌细胞株CNE-2Z中的肿瘤干细胞样细胞。方法：(1)取鼻咽癌细胞株CNE-2Z普通培养至对数生长期的细胞,消化后分别细胞计数,密度达到1×103/ml.1×104/m1、1×105/ml、1×106 ／ml时,分别加入无血清培养液中继续培养,以0.3%台盼蓝计数第0、1、3、5、7、9天活细胞百分率；(2)制备普通培养活细胞和第9天无血清培养活细胞爬片,用CD133和CD44人抗鼠单克隆抗体免疫组化染色；(3)用第9天无血清培养活细胞制备电镜观察标本并进行电镜观察。结果：(1)细胞密度为1×103／ml.1×10/ml.1×105/ml.1×106/ml时的细胞悬液再经无血清悬浮培养至第9天时,其中的活细胞百分率分别是0.00%、0.05%、3.10%、0.27%,以1 x1 05/ml组活细胞比率最高；(2)普通培养细胞爬片的CD133和CD44细胞强阳性率分别是2.71%和3.00%,而无血清培养细胞爬片的CD133和CD44强阳性率分别为66.7%和67.00%,两种培养方法强阳性细胞比较,差异有非常显著性统计学意义(P<0.01),CD133和CD44在两种培养液中强阳性细胞百分率相关性分析呈正相关(P<0.01)；(3)扫描电镜和透射电镜观察所见CNE-2Z鼻咽癌细胞中肿瘤干细胞样细胞表面有鳞片样改变,伴有出芽样突起,透射电镜下,细胞呈现较大异质性,可为圆形或椭圆形,细胞核固缩,细胞质极度浓缩和细胞器严重减少,可见类凋亡(?)小体以类似出胞的方式排出胞外。结论：1.无血清悬浮培养法可富集CNE-2Z鼻咽癌细胞中的肿瘤干细胞样细胞,1×105/ml的细胞浓度是CNE-2Z鼻咽癌细胞的最佳悬浮培养细胞密度。无血清悬浮培养法是一种比较经济、易于掌握的培养肿瘤干细胞的较好方法,值得推广应用。2.CD1 33和CD44可作为鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞的表面标志物而应用于鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞的检测；在无血清悬浮培养液中,鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞以自我复制和增殖两种方式分裂生长,但生长缓慢。3.电子显微镜下,鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞的形态特征有较大异质性,细胞核固缩,细胞质极度浓缩和细胞器严重减少,细胞质中可见类凋亡(?)小体以类似出胞的方式排出胞外,这些变化可能与无血清环境改变了细胞的生物学特性有关。第二章：鼻咽癌细胞株CNE-2Z肿瘤干细胞样细胞的生物学特性及益气解毒方对其分化潜能的干预效应目的：研究鼻咽癌细胞株CNE-2Z中肿瘤干细胞样细胞的生物学特性及益气解毒方对该类细胞分化潜能的干预效应。方法：(1)采用无血清悬浮培养方法富集CNE-2Z鼻咽癌细胞中的肿瘤干细胞样细胞球；(2)分别采用无血清悬浮培养转含胎牛血清的普通培养法及持续无血清培养法检测培养体系中悬浮细胞球的克隆形成能力、分化增殖能力,并以不同密度的细胞球悬液注射至裸鼠皮下,观察其成瘤能力；(3)用益气解毒方含药血清配制的温育液与无血清悬浮培养所得肿瘤干细胞样细胞球共培养,分别设立普通组和空白对照组,比较24 hrs、72 hrs、5天等时间段时细胞球中CD133/CD44阳性细胞数的变化。结果：(1)将培养体系中获得的CNE-2Z鼻咽癌细胞球吹散后再行无血清悬浮培养,仍然可形成细胞球；将这样的细胞球转至普通培养,24 hrs后可见在培养体系中有单个细胞贴壁生长,7天后细胞球消失；贴壁生的细胞的形态特征与原亲代细胞无异；对这些贴壁细胞的免疫组化检测显示CD133+/CD44+细胞阳性率逐日下降,各时段比较均有统计学意义(P<0.05)；交替培养时,目标细胞在细胞球和贴壁细胞之间交替出现,细胞(球)形态无明显改变；(2)无血清悬浮培养细胞球经洗涤后,分别以1×103、1×105、1×107的细胞密度进行裸鼠皮下注射,均可形成移植瘤,肿瘤生长速度与注射的细胞密度有关；移植瘤原代培养细胞生长速度明显快于其来源的亲代细胞株细胞(P<0.05)；(3)益气解毒方含药血清温育液中CD133/CD44阳性细胞下降速率明显快于普通培养组和对照组,各时段与普通组、对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论：1、无血清悬浮培养法所得CNE-2Z鼻咽癌细胞球具有自我更新、高速分化增殖和高效体内成瘤等肿瘤干细胞特性,可能为其中的肿瘤干细胞样细胞群。2、益气解毒方体外作用对CNE-2Z鼻咽癌细胞中的肿瘤干细胞样细胞具有明显的分化诱导效应。第三章：益气解毒方对CNE-2Z鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤中肿瘤干细胞样细胞干预作用的初步研究目的：探讨益气解毒方对CNE-2Z鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤组织中肿瘤干细胞样细胞的干预效应,比较不同给药方案对这类肿瘤干细胞样细胞的干预效率以及对裸鼠生存质量的影响。方法：建立CNE-2Z鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤模型；随机分为模型组、中药组(益气解毒方组)、DDP组(顺铂)和联合用药组(益气解毒方+DDP),分别给予生理盐水、益气解毒方药液、顺铂单药和益气解毒方药液+顺铂处理；观察用药前后各组移植瘤裸鼠体重、皮肤颜色、移植瘤瘤体大小、一般生活状态等相关指标变化；用药2周后获取移植瘤瘤组织标本,免疫组织化学染色法测定并分析比较各组移植瘤组织细胞CD133和CD44表达情况,western blotting法检测各组移植瘤组织CD133和CD44蛋白含量。结果：1)四组移植瘤裸鼠用药前后的体重变化表现为：模型组和益气解毒方组用药前后体重比较有非常显著性差异(P<0.01),联合用药组和DDP组用药前后体重比较无显著性差异(P>0.05)；移植瘤瘤体大小变化表现为：益气解毒方组、联合用药组、DDP组三组与模型组比较均有显著性差异(P<0.05),益气解毒方组、联合用药组、DDP组抑瘤率依次为18.7%、58.4%、43.8%；皮肤颜色和生活状态变化表现为：模型组和益气解毒方组用药前后无明显差异,联合用药组和DDP组用药前后有显著性差异,即皮肤颜色变暗,生活活力下降,尤其DDP组明显。2)四组裸鼠移植瘤中CD133/CD44蛋白质的western blotting检测结果为：在Mark条带120 kDa.80-95 kDa分子量附近均出现相应蛋白质条带。但各组移植瘤标本的相应蛋白质条带亮度有差异。模型组最亮,益气解毒方组和DDP组较亮,联合用药组最暗。联合用药组与DDP组、益气解毒方组、模型组比较亮度差异有显著性。3)四组裸鼠移植瘤组织中CD133和CD44免疫组化检测结果：CD133的表达为各用药组与模型组比较均有显著性差异(P<0.05),益气解毒方组、DDP组与联合用药组比较有显著性差异(P<0.05),益气解毒方组与DDP组比较无显著性差异(P>0.05)；CD44的表达结果与CD133相近,即各用药组与模型组比较均有显著性差异(P<0.05)；益气解毒方组、DDP组与联合用药组比较有显著性差异(P<0.05)；益气解毒方组与DDP组比较无显著性差异(P>0.05)；CD133和CD44比较,除联合用药组外,各组CD44阳性表达率明显高于CD133,二者相关性分析表现为高度正相关(P<0.01)。结论1.CNE-2Z鼻咽癌细胞移植瘤组织中存在少量鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞,且CD44阳性细胞表达率高于CD133；作为鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞的表面标志物而言,二项指标中究竟哪一项具有更高的特异性,有待进一步阐明。2、顺铂单药组中CD133/CD44阳性细胞表达率明显高于联合用药组,提示抗癌药物顺铂可能有富集鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞的作用；而中药益气解毒方可能对鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞具有诱导分化作用。3、在几种给药方案中,单纯使用中药的抑瘤能力有限,单纯使用化疗药则对荷瘤机体损害较大,中西医结合用药方案则在提高宿主生存质量、有效杀灭癌细胞乃至肿瘤干细胞方面具有协同作用,不啻为一种更为合理的用药选择。