论文部分内容阅读
一、研究背景与目的肝脏是体内进行代谢的重要器官,主要功能是对内源性物质及外源性物质(包括摄入的食物,药物)进行生物转化:包括氧化还原,水解,结合等一系列化学反应,物质的结构经反应后发生改变。这些反应几乎都需要代谢酶的参与,肝脏中代谢酶的含量十分丰富。肝癌是发生在肝脏的恶性肿瘤,按发生来源可分为原发性肝癌和转移性肝癌,其中肝癌患者90%以上为原发性肝癌,原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞癌,胆管细胞癌和混合型肝癌。肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)在我国发病率高,男性明显高于女性,死亡率高,已成为我国恶性肿瘤第二位。肝内代谢酶在肝的疾病状态下会发生某些改变,许多肝病最终都会发展成肝细胞癌,这些改变会影响药物在体内的代谢过程,从而改变药物的疗效或导致肿瘤细胞对药物的敏感性改变以及药物在体内蓄积中毒等问题。了解HCC患者肝细胞内药物代谢酶的催化能力的改变以及它们在肿瘤组织中的蛋白表达水平和基因水平的变化很有意义。目前,肝病对酶的影响研究偏重于对P450细胞色素的改变上,对UGTs的关注相对较少,因此很有必要对肝癌在UGTs上的影响作一个规律性的研究,为肝癌患者体内代谢酶的改变以及药物代谢过程的改变提供更多信息。所以本论文选择数十例HCC病例,研究肝细胞内表达丰富且作用广泛地UGT1A4和UGT2B7在同一个体癌旁组织(Pericarcinomatous tissue)与肿瘤组织(Tumor tissue)中催化活性以及蛋白与基因表达量的差异,还研究了两种具有抗癌活性的黄酮化合物在肿瘤组织中被UGT代谢情况的改变,以揭示肝癌是如何影响代谢的,并探讨其初步机理。UGT1A4主要催化胺类化合物的N-葡萄糖醛酸化,UGT2B7对临二苯酚结构具有特异选择作用,为体内雌激素活性的调节作了重要贡献,对多类外源性药物有较强的催化活性,包括麻醉镇痛药(吗啡)、有羧基的非甾体抗炎药(酪洛芬)、抗癌药(全反式维甲酸)。天然黄酮化合物具有保肝作用,在体内主要经过结合反应,代谢失活,排出体外,它们代谢情况的改变可直接反应代谢酶的活性的变化。二、研究方法与技术经过南方医院道德伦理委会批准,取回HCC患者外科手术后的肝组织,采用差速离心法制备人肝微粒体(human liver microsomes,HLM),用RNA抽提试剂盒提取组织总RNA。采用药物体外微粒体代谢研究方法,选取四个化合物:UGT1A4的特异性底物—他莫昔芬,UGT2B7的特异性底物—齐多夫定,具有抗肿瘤活性的天然黄酮化合物白杨素(Chrysin)和汉黄芩素(Wogonin),测定相同个体中癌旁组织微粒体(Pericarcinomatous HLM)与肿瘤组织微粒体(Tumor HLM)中代谢酶的代谢速率及其酶动力学参数,从而对肿瘤细胞中药物代谢酶催化活性的改变与差异作出结论和评价。代谢速率以每毫克蛋白每分钟生成的代谢产物的量表示(pmol or nmol/min/mg),采用XL-Kinetics软件对酶代动力学数据进行拟合,根据Eadie-Hofstee图初步判断酶代动力学曲线的模型,采用阿开克(氏)信息判据(Akaike’s information criterion,AIC)以及相关系数的平方(R2)对各个侯选模型进行判别,经软件拟合后得到酶动力学参数。为了进一步解释UGT代谢酶在肿瘤组织中催化活性发生改变的初步机理,我们采用蛋白免疫印记法(Western blot),研究UGT1A4,UGT2B7酶的蛋白表达量在肿瘤组织与癌旁组织中的差异,将提取得到的RNA逆转录成cDNA,进行实时荧光定量特异酶链扩增(Realtime-PCR),阐明这两种酶在基因水平上产生的改变,对活性的改变作出初步推测。采用Quantity one对western-blot所得到的扫描胶片进行光密度值定量分析。RT-PCR的扩增结果用ABI-7500 software进行采集分析,相对定量。本文涉及到的比较均采用 SPSS 13.0 两独立样本 t 检验(Independent-Samples T-test)进行统计学分析。三、实验结果1.HLM对UGT1A4底物他莫昔芬的葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学研究18例样本(分别编号)的癌旁组织微粒体混合液即pooled pericarcinomatous HLM(pooled-PHLM)与肿瘤组织微粒体混合液pooled tumor HLM(pooled-THLM)以及商业化的混合微粒体commercial HLM(C-HLM)对他莫昔芬的代谢均符合底物抑制型(Substration inhibition)动力学特点,C-HLM对他莫昔芬的表观动力学参数与目观值有较大出入,可能是由于目前的酶动学模型还存在一定的缺陷,所以用观测值Rate代替Vmax,Km也用观测数据来表示,而pooled-PHLM和pooled-THLM的参数是用XL-Kinetics软件模拟得出,因此与C-HLM的观测值做比较时只从清除率方面讨论,pooled-THLM对他莫西芬的清除率为 3.78 μL/min/mg,pooled-PHLM 为 9.64 μL/min/mg,与肿瘤组织微粒体相差3倍左右,C-HLM的清除率为9.68 μL/min/mg,与pooled-PHLM清除率接近。三种微粒体对他莫昔芬代谢的Km范围在26-70 μM,因此高中低三浓度设置为10 μM,37.5 μM,100 μM以考察单个样本中PHLM与THLM的活性差异。经两独立样本t检验,各浓度内不同病例THLM对他莫西芬的代谢速率均较PHLM低,两者比较具有显著的统计学差异(P<0.05),但差异程度有较大的个体差异,从2-20倍不等。2.HLM对UGT2B7底物齐多夫定葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学研究pooled-PHLM、pooled-THLM以及C-HLM对齐多夫定的代谢均符合经典米氏方程(Michaelis-Menten equation)动力学特点,C-HLM对齐多夫定的表观酶动学参数 Vmax 为 1830.8 pmol/min/mg,Km 为 1844.6 μM;pooled-PHLM 对齐多夫定的表观动力学参数Vmax为2050.8 pmol/min/mg,Km为1759.4 μM;pooled-THLM对齐多夫定的表观动力学参数Vmax为405.4 pmol/min/mg,Km为2885.3μM。三种微粒体对齐多夫定代谢的Km范围在1700-1900 μM,因此高中低三浓度设置为250 μM,1500 μM,3500 μM以考察单个样本中PHLM与THLM的活性差异。经两独立样本t检验,各浓度内不同病例THLM对齐多夫定的代谢速率均较PHLM低,两者比较具有显著的统计学差异(P<0.05),差异程度相差较大,从3-70倍不等。3.HLM对黄酮化合物—白杨素的葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学研究pooled-PHLM、pooled-THLM以及C-HLM对白杨素的代谢均符合经典米氏方程(Michaelis-Menten equation)动力学特点,C-HLM对白杨素的表观酶动学参数 Vmax 为 5.2 nmol/min/mg,Km为 3.7μM;pooled-PHLM 对白杨素的表观动力学参数 Vmax 为 5.6 nmol/min/mg,Km 为 4.8 μM;pooled-THLM 对白杨素的表观动力学参数 Vmax 为 2.7 nmol/min/mg,Km 为 4.7 μM。三种微粒体对白杨素代谢的Km范围在3.7-4.8 μM,因此高、低两浓度设置为1 μM,25 以考察单个样本中PHLM与THLM的活性差异。经两独立样本t检验,12例中有11例THLM对白杨素的代谢速率均较PHLM低,有一例THLM比PHLM要高,两者比较均具有显著的统计学差异(P<0.05)。4.HLM对汉黄芩素葡萄糖醛酸化代谢的酶动力学研究pooled-PHLM、pooled-THLM以及C-HLM对汉黄芩素的代谢均符合经典米氏方程(Michaelis-Menten equation)动力学特点,C-HLM对汉黄芩素的表观酶动学参数 Vmax 为 4.4 nmol/min/mg,Km 为 2.4 μM;pooled-PHLM 对汉黄芩素的表观动力学参数 Vmax 为 4.2 nmol/min/mg,Km 为 2.0 μM;pooled-THLM 对汉黄芩素的表观动力学参数Vmax为2.0 nmol/min/mg,Km为2.8 μM。三种微粒体对汉黄芩素代谢的Km范围在2.0-2.8μM,因此高、低两个浓度设置为0.5 μM,15 μM,以考察单个样本中PHLM与THLM的活性差异。经两独立样本t检验,各浓度内10个病例THLM对汉黄零素的代谢速率均较PHLM低,两个病例有相反的结果,两者比较具有显著的统计学差异(P<0.05)。5.HCC癌旁组织与肿瘤组织中UGT1A4,UGT2B7蛋白表达水平的比较研究用蛋白免疫印迹法检测,12例肿瘤组织中UGT2B7酶蛋白的表达与对应的癌旁组织相比均有不同程度的降低,在12例样本中有9例的癌旁组织中UGT1A4酶蛋白比配对的肿瘤组织表达量要低,有三例相反。pooled-THLM中UGT1A4和UGT2B7蛋白的表达均低于pooled-PHLM。用Quantity One软件进行光密度值比较,结果均有统计学差异(P<0.05)。6.HCC正常组织与肿瘤组织中UGT1A4和UGT2B7基因表达水平的比较研究根据实时荧光定量的结果,UGT1A4mRNA在12例肿瘤组织中的表达均低于对应的癌旁组织,UGT2B7 mRNA在11例肿瘤组织中比癌旁组织表达量少,有1例结果相反。用两独立样本t检验,两者比较有统计学差异(P<0.05)。四、结论1、HCC患者肿瘤组织中UGT1A4的催化能力在不同底物浓度下降至癌旁组织的1/2-1/20不等,酶蛋白表达量也有下降趋势,mRNA水平也全都下调,提示HCC发生发展过程中影响了 UGT1A4的mRNA,从而使蛋白的表达下降,代谢活性降低。2、HCC患者肿瘤组织中UGT2B7的催化能力在不同底物浓度下降至癌旁组织的1/3-1/70不等,酶蛋白表达量也有所降低,mRNA水平也有下调趋势,提示HCC发生发展过程中影响了 UGT2B7的mRNA,从而使蛋白的表达下降,代谢活性降低。3、白杨素和汉黄芩素都是由多种UGT亚型所代谢,在肝癌组织中这两种化合物代谢情况的变化能间接反应UGT整体的活性变化,从结果可以发现UGT整体的活性也有下降的趋势,其变化比UGT1A4或UGT2B7单个亚型的变化幅度要小,日后可能需要找到其他亚型的特异性底物单独了解其他亚型的变化,对临床用药给出更具体的信息。4、18例HCC病例HBV均为阳性,提示HBV对代谢酶的活性、蛋白表达及基因表达的调控有影响。