防御素(defensin)是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类重要的抗菌肽类物质。它具有十分广泛的抗菌谱,可以抵抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物,尤其是哺乳动物防御素除了对细菌、真菌、被膜病毒有毒杀作用外,还对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞有杀伤作用。另外,防御素具有刺激机体产生免疫应答的作用,它可以通过趋化因子受体招募未成熟的树突细胞与巨噬细胞到达微生物入侵的皮肤和粘膜组织,从而刺激机体产生对病源菌的特异性免疫。因此防御素在医药工业上具有广泛的开发和应用前景。目前,哺乳动物防御素主要有α、β、θ三种。其中在畜牧生产领域中,动物β-防御素有较好的研发价值。人们已证明猪β-defensin-2具有较强的杀伤病源微生物的作用,并且β-defensin-2杀菌机理独特,病源菌不易对其产生耐药性。近年来,随着基因工程技术的发展,人们希望通过生物工程手段来大量生产防御素。由于生物体内天然防御素的含量很低,且提取步骤繁琐,而化学合成法成本又很高,因此用基因工程方法大量生产防御素无疑是最佳选择。采用基因工程的方法合成β-defensin-2目的片段,并将其导入毕赤酵母中进行表达,构建β-defensin-2的酵母工程菌,以工程菌工业化发酵生产β-defensin-2,可以很大程度的降低β-defensin-2生产成本,并且适合进行大规模工业化生产,生产周期短,生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。此外,β-defensin-2能耐受高温,规模化发酵生产β-defensin-2时经高温浓缩工序,可充分杀死酵母菌体而不导致β-defensin-2失活,产品在推广后不会出现工程菌扩散而导致环境的生态问题。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统,近年来,它越来越受到人们的重视并被广泛应用。主要原因是它与传统的酵母表达体系,如酿酒酵母(Saccharomyces ceresiviae)表达体系相比,有许多优点:(1)毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达;(2)毕赤酵母是需氧酵母菌,在有氧条件下能高密度生长,因此有利于扩大生产获得高浓度细胞,从而进行高效表达;(3)毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少,使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离;(4)通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定,不易丢失;(5)外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中,因此能够筛选到高表达菌株;(6)毕赤酵母对外源蛋白产物进行N-乙酰糖基化修饰后的结构为高甘露糖型,糖链平均为8～14个甘露糖基,更接近于高等生物,且聚糖末端不含α-1,3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性),因而适用于临床应用;(7)使用方便、简单,而且成本较低。目前主要有三种表达宿主菌,它们的主要区别在于AOX一个基因或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力的改变。最常用的宿主菌是GS115(his4),它含AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基上以野生型速度生长,它的表现型是Mut~+。KM71(his4 arg4 aox1△::ARG4)宿主菌的AOX1已被S.cereavisiae的ARG4替代,因此,此宿主菌只能依赖AOX2基因合成AOX,在含甲醇的培养基上低速度生长,它的表现型是Mut~S。第三种宿主菌MC100-3(his4arg4 aox1Δ∷SARG4 AOX2A∷Phis4)的两个AOX基因都被除去,不能在含甲醇的培养基上生长,它的表现型是Mut~S或Mut~-。上述的宿主菌的改造还可得到其他衍生的宿主菌,如SMD1163、SMD1165和SMD1168是近来开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌,它们为表达外源蛋白提供了一个减少降解的环境,有广泛的应用价值。本实验根据已发表的猪β防御素2(pBD-2)氨基酸序列,参照酵母密码子的偏爱性,设计猪β防御素2的目的基因序列,交由公司合成。将合成的目的基因片段通过SnaB I和NotI位点克隆至分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后的下游序列中,构建了表达载体pPIC9K-pBD-2。用Sal I将pPIC9K-pBD-2线性化后,采用电穿孔法转入毕赤酵母GS115中进行表达。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pPIC9K-pBD-2对毕赤酵母的高效电转化方法。通过MD平板、MM平板、G418筛选得到Mut~+表型的高拷贝转化子,经PCR检测该转化子已正确整合入毕赤酵母染色体中。阳性克隆经摇瓶发酵和甲醇诱导,发酵上清液以SDS-PAGE进行分析,利用琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性。结果表明,防御素pBD-2基因在毕赤酵母中得到表达,表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。为了更好地利用基因工程技术来开发重组猪β-防御素制剂,本研究将去除信号肽的猪β-防御素2基因置于表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建成能分泌表达pBD-2蛋白的重组表达载体pPIC9K/pBD-2,然后将其导入高效表达系统-毕赤酵母GS115中,培养重组酵母表达防御素蛋白。本研究在国内外首次在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的pBD-2蛋白,为猪β防御素2基因工程新制剂的生产和应用奠定了基础。