论文部分内容阅读
背景：食管癌是人类常见的恶行肿瘤之一，具有病死率高、术后生存期短的特点，发病具有明显的地域性，世界上约有一半的食管癌发生在我国，其中山西、河南、河北等太行山区是食管癌的高发区。有研究表明在食管癌的发生过程中一些抑癌基因的缺失及表达降低对食管癌的发生发展起到关键作用。食管癌相关基因2(Esophageal Cancer Related Gene2，ECRG2)是通过mRNA差异显示技术从河南林县食管癌高癌家族和正常成人食管上皮中成功分离克隆的食管癌相关基因。前期的研究结果表明ECRG2基因的缺失可以导致染色体的不稳定性，异倍体的产生；ECRG2的表达可以抑制肿瘤细胞增殖，可能是新的抑癌基因。目的：本课题拟在大量食管癌组织样本中观察ECRG2基因的突变情况，并且在细胞水平、动物水平进一步探讨ECRG2基因对肿瘤生长、转移的作用。方法：本课题组应用二代测序技术对14例食管癌癌组织及癌旁组织进行全基因组测序及97例食管癌及癌旁组织进行外显子组测序，在大量食管癌患者组织中检测ECRG2的突变情况。同时应用一些生物信息学软件，对ECRG2蛋白的相关特性进行初步预测。采用基因重组的方法构建携带GFP/LUC标记的ECRG2慢病毒表达载体及慢病毒敲低载体。将过表达载体转染食管癌细胞系KYSE150，将敲低载体转染食管癌细胞系ECA109，通过抗生素及流式分选相结合的方法筛选出稳定表达ECRG2的细胞株及敲低ECRG2基因的细胞株。通过RT-PCR和蛋白印迹技术在RNA水平和蛋白水平对筛选好的细胞进行鉴定。同时在细胞水平对筛选出的细胞株进行功能研究。采用划痕实验、Transwell实验对细胞的迁移、侵袭能力进行研究。采用流式细胞仪对细胞周期进行分析。结果：在食管癌组织样本中没有发现ECRG2基因的突变，但是在ECRG2基因所在的5q区存在大量基因拷贝数的缺失，提示ECRG2在食管癌中的表达缺失的可能原因为拷贝数降低。应用软件对ECRG2蛋白的结构进行预测，发现4个ECRG2蛋白磷酸化位点和10个与ECRG2相关的蛋白质。成功构建ECRG2的慢病毒表达载体及敲低载体，并且筛选出稳定表达及敲低ECRG2基因的细胞株，表达ECRG2的细胞株在迁移侵袭实验中可以抑制细胞的迁移侵袭。结论：ECRG2基因在食管癌中可能由于拷贝数降低而导致其表达缺失，ECRG2基因可以抑制食管癌细胞的侵袭、迁移；稳定表达ECRG2基因的克隆细胞可用于后续动物实验。