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目的;探讨氯通道在神经元凋亡中的作用,为研究缺血性脑损伤神经元凋亡机制和靶点药物开发提供实验参考。
方法:采用培养处于对数生长期的PC-12细胞,随机分为Control组（正常对照组不经任何处理,只加正常培养基）、细胞凋亡组(过氧化氢组(H2O2)诱导凋亡）、和+DIDS组（在诱导凋亡的同时加DIDS）,每组设6个复孔。实验时,H2O2作用于细胞的时间是12小时;H2O2+DIDS组中,DIDS与H2O2同时加入培养基中,作用12小时。找出最佳过氧化氢浓度作为诱导凋亡模型使用浓度;找出DIDS的最佳使用浓度作为实验组的药物干预浓度。采用CKK-8法检测细胞生存率、Hoechst33342荧光染色和免疫印迹caspase-3和bcl-2凋亡蛋白测定检测细胞凋亡、流式细胞术定量分析。
结果:(1)H2O2诱导PC-12凋亡具有浓度依赖性,随H2O2浓度的增加,其诱导PC-12凋亡的作用相应增强。当H2O2的浓度为0、50、100、200、300、400、500、600nmol/LPC-12生存率分别是98.10±1.10％、95.60±5.21％、86.59±3.61％、70.52±1.00％、61.89±1.98％、49.30±2.66％、31.84±0.66％、19.00±0.78％。100～600nmol/L各组生存率与0nmol/L组生存率相比具有统计学差异(P＜0.01,n=6)。400nmol/L的H2O2模拟的效果最符合实验要求,在之后实验中建立凋亡的模型采用此浓度。(2)氯通道阻断剂DIDS可以对抗H2O2诱导的PC-12凋亡并呈浓度依赖性。正常组的细胞生存率是97.20±0.33％,0、10、50、100、200、300、400、500μmol/L浓度的DIDS细胞生存率分别为53.22±1.20％、52.22±1.91％、70.72±2.00％、83.74±2.10％、81.79±1.60％、80.69±1.80％、72.32±2.00％、60.01±1.60％,50～500μmol/L各组与0μmol/L组相比具有统计学差异(P＜0.01,n=6),在后续的本实验中DIDS均采用100μmol/L浓度。(3) Hoechst33342对细胞核染色结果显示,正常组中细胞核形态为卵圆形或锥形,发出淡蓝色的荧光,细胞凋亡发生率为5.56±0.81％;模型组(400nmol/L)中细胞胞核浓缩变小呈强亮色荧光,凋亡发生率为51.06±2.38％,与Control组凋亡率相比具有显著差别(P＜0.01,n=6);治疗组(100μmol/L)的细胞凋亡发生率为21.26±1.36％,与H2O2组相比具有显著性差别(P＜0.01,n=6)。(4) Western blot结果显示为Control组Caspase-3蛋白的相对表达量为0.13±0.032; H2O2组(400nmol/L)中Caspase-3蛋白相对表达量是0.59±0.024,与Control组相比具有显著性差别(P＜0.01,n=6); H2O2+DIDS组中Caspase-3蛋白相对表达量是0.25±0.018,与H2O2组相比具有显著性差别(P＜0.01,n=6);而bcl-2结果显示Control组bcl-2蛋白的相对表达量为0.21±0.024;H2O2组(400nmol/L)中bcl-2蛋白相对表达量是0.53±0.097,与Control组相比具有显著性差别(P＜0.001,n=6); H2O2+DIDS组中bcl-2蛋白相对表达量是1.13±0.033,与H2O2组相比具有显著性差别(P＜0.01,n=6)。(5)流式细胞技术显示;正常组PC-12凋亡率为7.45±1.25％,H2O2组凋亡率为50.27±1.23％。与Control组相比(P＜0.01,n=6);H2O2+DIDS组中细胞凋亡率为26.57±0.95％,与H2O2组相比(P＜0.01,n=6)。
结论:(1) H2O2诱导PC12凋亡具有浓度依赖性。
(2)氯通道阻断剂DIDS能够拮抗H2O2诱导的细胞毒性作用并呈浓度依赖性。
(3)氯通道阻断剂DIDS能够影响相关凋亡蛋白的表达。
(4)氯通道可能参与了H2O2诱导细胞的凋亡。