论文部分内容阅读
第一部分焦亡与大鼠脑缺血再灌注损伤的相关性研究目的:研究大鼠脑缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion,I/R）模型中,NLRP3炎症体相关蛋白包括凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）,NLRP3,半胱氨酸天冬氨酸酶-1前体（pro-Caspases-1）,半胱氨酸天冬氨酸酶-1 p20 片段（Caspases-1 p20）,gasdermin D 蛋白（GSDMD）和 gasdermin D蛋白氨基端片段（GSDMD-N）在I/R损伤后不同时间点的水平变化以及ASC,NLRP3,和pro-Caspase-1三者在I/R脑损伤过程中的相互作用水平变化。方法:1、随机选取6只体重在320～330g之间的成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠作对照（Sham）组处理,另选取36只体重在320～330g间成年健康雄性SD大鼠制备大脑中动脉栓塞/再灌注模型（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）,按再灌注后6h、12h、24h、48h、96h平均分为5组,每组6只。建模后大鼠若死亡则随机选取大鼠造模以补足每组大鼠数量。2、每组存活大鼠在相应时间点取脑脊液标本留存后处死,并取梗死灶周围1.5-2mm范围内脑组织,用蛋白质免疫印迹实验（Western blot,WB）检测与焦亡发生密切相关的 NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Caspase-1 p20、GSDMD 和 GSDMD-N蛋白的水平,运用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）技术分析NLRP3、ASC和pro-Caspase-1三者的相互作用水平,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脑脊液标本中炎症因子白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）的水平。结果:1.I/R 后 Caspase-1 p20、GSDMD 和 GSDMD-N 的水平均升高,以 I/R 后 24h 组最显著。2.I/R 24h后NLRP3、ASC和pro-Caspase-1的相互作用水平显著升高。3.I/R后,与焦亡发生密切相关的炎性因子IL-1β、IL-18水平增加,且I/R后24h最显著。结论:1.I/R后NLRP3炎症体被激活,与焦亡发生密切相关的NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白在I/R后24h的水平最高。2.焦亡执行蛋白GSDMD及其片段GSDMD-N的水平在I/R 24h达到峰值。第二部分基因与药物干预焦亡通路对大鼠MCAO/R后脑损伤的影响目的:研究Caspase-1特异性抑制剂Z-yVAD-FMK（yVAD）和基因干预GSDMD对于大鼠I/R后焦亡程度及大鼠脑损伤程度的影响。方法:1、随机选取90只体重在320～330g之间的成年健康雄性SD大鼠平均分为假手术（Sham）组、MCAO/R 组、MCAO/R+Ctr-siRNA（干扰对照）组、MCAO/R+siRNA-GSDMD（干扰）组、MCAO/R+vector（过表达对照）组、MCAO/R+Over-GSDMD（Overexpression-GSDMD,过表达 GSDMD）组,共 6 组,每组12只。剩余18只大鼠随机平均分为MCAO/R+Vehicle组、MCAO/R+yVAD组、MCAO/R+Over-GSDMD+yVAD组,共3组,每组6只,对上述各组进行相应的药物或基因干预后建立MCAO/R模型。建模大鼠发生若死亡则随机选取补足每组大鼠数量。2、在假手术（Sham）组、MCAO/R 组、MCAO/R+Ctr-siRNA（干扰对照）组、MCAO/R+siRNA-GSDMD（干扰）组、MCAO/R+vector（过表达对照）组、MCAO/R+Over-GSDMD组中每组任意选取6只模型大鼠在MCAO/R 24h后先进行神经学评分评估大鼠预后,然后处死取切片进行TTC染色分析梗死面积,每组剩余6只大鼠在MCAO/R 24h后先取脑脊液,然后处死并取梗死灶周围缺血半暗带范围内脑组织留用。利用Western blot与ELISA实验检测上述8组大鼠脑组织中焦亡相关蛋白的表达与脑脊液中炎症因子IL-1β和IL-18的水平。结果:1.MCAO/R 24h后,yVAD干预组Caspase-1和GSDMD的水平较相应的对照组变化不显著,而Caspase-1 p20和GSDMD-N的水平较对照组显著减少,同时脑脊液中炎症因子IL-1β和IL-18的水平显著下降。2.MCAO/R 24h 后,siRNA-GSDMD 组 Caspase-1 和 Caspase-1 p20 的水平较对照组无显著差异,而GSDMD和GSDMD-N的水平较对照组显著减少,同时脑脊液中炎症因子IL-1β和IL-18水平显著下降,神经学预后评分及梗死灶面积较对照组改善。3.MCAO/R 24h 后,Over-GSDMD 组的 GSDMD 和 GSDMD-N 的水平较对照组显著增加,而Caspase-1和Caspase-1 p20的水平较对照组无显著差异,同时脑脊液中炎症因子IL-1β和IL-18水平显著升高,神经学预后评分及梗死灶面积较对照组恶化。4.MCAO/R 24h 后,Over-GSDMD+yVAD 组的 GSDMD 较单独 Over-GSDMD 组的水平无显著差异,而GSDMD-N、Caspase-1和Caspase-1 p20的水平较单独Over-GSDMD组的水平显著下降;同时脑脊液中炎症因子IL-1β和IL-18水平显著下降。结论:1.GSDMD是参与焦亡的关键蛋白,药物干预或基因干扰GSDMD的蛋白水平能改善I/R后脑损伤,而GSDMD的水平上升则加重了I/R后脑损伤。2.Caspase-1 p20是参与切割GSDMD的上游关键分子,给予Caspase-1特异性抑制剂y-VAD后,改善了缺血再灌注后的脑损伤程度。第三部分探究体外I/R模型下GSDMD在小胶质细胞中的亚细胞定位以及干预其相应的氨基酸位点对介导的小胶质细胞焦亡的影响目的:模拟体内I/R模型,研究体外氧糖剥夺/复糖复氧（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型中小胶质细胞发生焦亡时,GSDMD切割后的各片段以及对GSDMD进行膜定位干预,从而进一步探索小胶质细胞发生焦亡的机制。方法:1.原代培养小胶质细胞后,随机分成组:Control（对照）组,OGD/R+Vector组,OGD/R+GSDMD-FLeGFP组,OGD/R+GSDMD-NeGFP组,OGD/R+GSDMD-CeRFP组,O GD/R+GSDMDD280A 组,OGD/R+GSDMDE15K/L156D 组,OGD/R+GSDMD-NeGFP+GSD MD-CeRFP组。2、分别用流式细胞仪和共聚焦免疫荧光染色技术检测焦亡的发生和执行蛋白GSDMD及其片段的细胞定位,以验证对GSDMD切割位点干预后其对小胶质细胞损伤进程的影响。利用ELISA实验检测上述各组细胞培养的上清液中炎症因子IL-1β和IL-18的水平。结果:1、GSDMD-N在OGD/R+GSDMD-NeGFP组中出现在小胶质细胞的胞膜上,而GSDMD-C在OGD/R+GSDMD-CeRFP组中较多出现在小胶质细胞的胞质内。但是在OGD/R+GSDMD-NeGFP+GSDMD-CeRFP 组中,GSDMD-N 与 GSDMD-C 则共同出现在细胞质中,而在细胞膜上较少观察到GSDMD-N的存在。2、在OGD/R+GSDMD-CeRFP组中,IL-1β和IL-18分泌均呈现下降.且在GSDMD-NeGFP+GSDMD-CeRFP 共转染组中,OGD/R 后,IL-1β 和 IL-18 的水平较单纯转染GSDMD-NeGFP的OGD/R+GSDMD-NeGFP组呈现显著下降。3、在 OGD/R+GSDMDE15K/L156D组与 OGD/R+GSDMDD280A组中,GSDMD 可在小胶质细胞胞质中观察到而非胞膜上。4、与 OGD/R+GSDMD-FLeGFP 组相比,OGD/R+GSDMDE15K/L156D 组与OGD/R+GSDMDD280A组中的IL-1β和IL-18的水平出现显著下降。结论:1、在体外OGD/R条件下,GSDMD-N定位于细胞膜上执行诱导焦亡发生的作用,而GSDMD-C通过阻碍GSDMD-N向细胞膜的定位过程,抑制小胶质细胞焦亡的发生,对OGD/R后小胶质细胞的损伤起保护作用。2、第280位天冬氨酸（D280）是 GSDMD-FL被 Caspase-1 p20 切割为 GSDMD-N和GSDMD-C的关键氨基酸位点,将此位点突变可抑制GSDMD-FL分割产生GSDMD-N,从而抑制OGD/R后小胶质细胞焦亡的发生。3、第15位谷氨酸（E15）和第156位亮氨酸（L156）是GSDMD-N进行细胞膜定位引发焦亡的两个关键氨基酸位点,将上述两个位点同时突变可阻碍GSDMD-N向细胞膜处定位,进而抑制OGD/R后小胶质细胞焦亡的发生。