急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症（Acute Lung Injury/Acute RestpiratoryDistress Syndrome,ALI/ARDS）是在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中,肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿,导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。流行病学调查显示,ALI/ARDS是临床常见危重症。根据1994年欧美联席会议提出的ALI/ARDS诊断标准,ALI发病率为每年18/10万,ARDS为每年13～23/10万。2005年的研究显示ALI/ARDS发病率分别在每年79/10万和59/10万提示ALI/ARDS发病率显著增高,明显增加了社会和经济负担,这甚至可与胸部肿瘤、AIDS、哮喘或心肌梗死等相提并论。虽然不同研究对ARDS病死率的报道差异较大,总体来说,目前ARDS的病死率仍较高。对1967年～1994年国际正式发表的ARDS临床研究进行荟萃分析,3264例ARDS患者的病死率在50%左右。2001年3月至2002年3月上海市15家成人ICU中ARDS病死率也高达68.5%。ALI/ARDS的基本病理生理改变是多种炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）参与的肺脏局部炎症反应和（或）系统性炎症反应失控所致的肺泡毛细血管膜损伤、通透性增加所致的富含蛋白的非心源性肺水肿。由于肺水肿肺水含量增加,肺泡水肿导致肺泡表面活性物质层破坏,降低了肺的顺应性;肺泡水肿增加弥散距离,减少散面积及其后形成的肺泡透明膜致弥散障碍;肺血管痉挛和肺微小血栓形成加重了通气/血流比例失调,产生严重的低氧血症。严重者,因呼吸机疲劳,通气减少,致Ⅱ型呼吸衰竭。肺血管痉挛和肺微小血栓形成可引发肺动脉高压。肺水肿在ALI/ARDS的病理生理中起着重要作用。ALI/ARDS早期的病理特征为肺毛细血管内皮细胞与肺泡上皮细胞屏障的通透性增高,肺泡与肺间质内积聚大量的水肿液,其中富含蛋白及以中性粒细胞为主的多种炎症细胞。所以ALI/ARDS患者早期抗炎治疗的同时若能及时减轻,甚至治愈肺水肿,有助于逆转其病理生理过程,改善预后。不少临床研究已表明肺泡液体转功能的正常维持能降低ALI患者的死亡率。肺泡内液体的主动吸收机制发现以前仅以Starling机制来解释,即由于肺泡内外存在流体静力压和渗透压差异而导致水自肺泡吸收。自Matthay等发现了肺泡内液体的主动转运机制后,为更好地治疗肺水肿提供新的可能方法。目前认为肺水肿的主动重吸收为:Na⁺肺泡上皮细胞（包括肺泡Ⅰ型上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞）顶膜的上皮钠离子通道（ENaC）重吸收入细胞质,再经其基底膜侧的Na⁺,K⁺-ATPase泵入肺间质,Cl^-通过肺泡上皮细胞CFTR,K⁺通过K⁺通道跨细胞转运,从而形成跨肺泡上皮的渗透压差,使肺泡内的水通过单纯扩散或肺泡上皮膜的水通道进入肺间质。其中ENaC和Na⁺,K⁺-ATPase是两个重要的环节和调节位点。已发现多种调节肺泡液体主动转运的机制:CAMP介导的信号通路,多巴胺能通路,腺苷通路,激素通路,生长因子通路,丝氨酸蛋白酶通路等,其中CAMP介导的信号通路中的β₂肾上腺能受体（β₂AR）激动剂研究的最多并已进入不少临床试验中。β₂AR分布于肺的气道平滑肌和肺泡上皮,分布密度随气道级数增加而增加,90%以上分布于肺泡上皮。目前认为β₂AR激动剂短时间通过β₂AR激动剂-β₂AR-GPCR-CAMP-PKA-细胞骨架蛋白,促进细胞内的ENaC转运至细胞膜上增加肺泡上皮细胞膜ENaC数量;直接激活βENaC、γENaC;长时间作用增加αENaCmRNA促进αENaC的表达,增加ENaC数量,促进Na⁺的跨肺泡上皮转运促进肺泡液体的重吸收。ENaC由三个蛋白质亚基（αENaC、βENaC、γENaC）组成。分布于从鼻至肺泡的呼吸道上皮细胞膜。三个亚基以不同的方式组合形成了具有不同生物学特点和不同调节方式的钠离子通道。不同钠离子通道都包涵有αENaC,αENaC基因缺失的小鼠,很快死于肺内过多液而致的呼吸窘迫,γENaC基因缺失小鼠肺泡内液清除速度减慢,未死于呼吸系统并发症,βENaC、γENaC基因缺失小鼠患有假性醛固酮减少症,因失钠和高钾血症而死亡。由此可见αENaC对肺泡液体重吸收很重要。为此我们产生了β₂AR激动剂是否通过增加αENaC的基因表达增加肺泡上皮细胞ENaC的数量促进肺泡液体的重吸收设想,为此我们以αENaC为研究对象,选择经典的油酸ALI大鼠模型,以肺组织的肺水含量为指标观察特布他林这一临床中应用多年的β₂AR激动剂治疗早期（1小时）ALI大鼠肺水肿的效果,检测正常组大鼠,ALI/ARDS状态组大鼠和β₂AR激动剂组大鼠远端肺组织αENaCmRNA和αENaC蛋白表达,研究特布他林短时间作用增强油酸急性肺损伤大鼠肺泡液清除的机制与αENaC的相关性,为探索β₂AR激动剂治疗ALI的机制,为ALI的治疗选择可行、有效方法提供参考。材料和方法1,实验分组:按随机数字法将24只200～220g的SPF级雄性SD大鼠（南方医科大学实验动物中心提供）分成正常组,ALI组和特布他林治疗组共3组,n=8。2,油酸ALI大鼠模型的复制:经腹腔动脉抽血测血气分析后再,注射高纯度油酸0.08ml/kg,可观察大鼠呼吸急促、颜面部皮肤粘膜发绀,1h后再抽腹腔动脉血,测血气分析,并放血活杀,取材HE染色,根据PaO₂氧合指数,HE染色结果判断模型是否复制成功。3,肺水肿吸收效果的测定:特布他林治疗组经气管插管滴入硫酸酸特布他林气雾剂4×10^-4mol/L 1ml/kg,放血活杀后,取相同部位肺组织测定湿重,再在80℃烤箱内放置72hs,再称肺组织干重,肺水含量=肺湿重-肺干重/肺湿重×100%。4,远端肺组织总α-ENaC mRNA表达测定:按Trizol(invitrogen TRIZOL^?Reagent)说明书提肺组织总RNA,选OD260/OD280比值在1.7～1.9的,再跑1%琼脂糖电泳,得到明亮的28S、18S和暗淡的5S三条带后,作合格标准,选来自合格总RNA的RT反应后的产物进qRT-PCR反应。采用ΔΔCt相对定量法定量分析各组间α-ENaCmRNA表达差异。5,远端肺组织总α-ENaC蛋白表达测定:用RIPA强裂解液提取远端肺组织总蛋白,以β-actin为内参western blot测定各组大鼠远端肺组织α-ENaC蛋白相对表达量。6,统计学方法:采用SPSS13.0统计软件分析,Microsoft Office Excel 2007作统计表。各组样本量正态性检验用对偏度和峰度来检验;各组间方差齐性检验用levene方差齐性检验,Pa0₂、Pa02/FiO₂油酸处理1 h前后对比用配对样本t检验,其余各组间差别检验用两独立样本t检验或Satterthwaite近似t检验,P≤0.05有统计学差异。3组均数比较则行one-way ANOVA方差分析,P≥0.1无统计学差异。结果1、ALI大鼠模型复制:1.1:各组大鼠临床表现:正常组大鼠呼吸无变化（呼吸频率（R）:60～90次/分）,无气管插分泌物,唇鼻部皮肤仍为粉红色;ALI组大鼠在下腔静脉注射油酸后,很快（2min）内出现持续呼吸急促（R:130～200次/分）,多数在30min后有叹气样呼吸,胸腹予盾运动,气管插管内泡沫状红色分泌物,大鼠唇鼻部皮肤发绀。1.2:ALI组油酸注射前及油酸注射后1h的PaO₂为:12.37±0.14、6.73±0.10;氧合指数为:441.87±5.18、240.38±3.52两指标两样配对t检验结果P值为别0.000和0.000,都小于0.05。1.3:肺组织病理学:大体观:正常组肺呈粉红色,肺形态正常,肺缘锐利;ALI组肺深红近紫色,肿胀,发亮,以双下肺为重,气道分泌物多;HE染色:正常组大鼠肺组织切片可见呼吸性支气管,肺泡管,肺泡等肺组形态正常清晰,肺泡腔不肿大,内无红染,肺泡壁、间质薄。ALI组的肺泡等组织形态欠清晰,肺泡腔扩大,内有红染（蛋白质性肺水肿）,正在形成透明膜;肺泡壁及间质明显增宽、充血,粒细胞显著增多、局灶性肺不张、坏死。2、特布他林促进ALI大鼠肺泡液体重吸收效果的观察:ALI组大鼠和特布他林治疗组大鼠的PaO₂:6.73±0.10、9.58±0.12;氧合指数:240.38±3.52、342.00±4.28;肺水含量:0.855±0.001、0.828±0.002经两样本t检验,P值分别为:0.000、0.000、0.000都小于0.05。HE染色:ALI组的肺组织形态欠清晰,肺泡腔扩大,内有红染（蛋白质性肺水肿）,正在形成透明膜;肺泡壁、间质明显增宽,充血,粒细胞显著增多,局灶性肺不张。特布他林治疗组的肺组织形态尚可,间质增宽,充血,但腔内大都清晰无红染,浸润粒细胞较ALI组的明显减少。3、各组大鼠远端肺组织α-ENaC mRNA的表达差异:正常组、ALI组和特布他林治疗组3组大鼠远端肺组织αENaC mRNA的相对表达量为别0.97±0.23、1.06±0.13和0.90±0.19,one-way ANOVA方差分析3者的差异:P=0.825＞0.1;各组大鼠远端肺组织α-ENaC蛋白的表达差异:3组αENaC蛋白相对表达量为0.217±0.003、0.213±0.002和0.217±0.002,P=0.344＞0.1。结论1、静脉注射0.08ml/kg高纯度油酸制备ALI大鼠模型成功;2、β₂AR激动剂特布他林能促进早期ALI大鼠的肺水肿重吸收;3、β₂AR激动剂特布他林能促进早期ALI大鼠的肺水肿重吸收不是通过增强α-ENaC基因表达实现。