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大豆凝集素(Soybean Agglutinin SB A)做为一种抗营养因子主要存在于饲料、食品等豆类制品中,由于其能凝集红细胞,影响营养物质的消化吸收,抑制动物生长,导致过敏反应等,在动物和人体内引发一系列抗营养作用,严重影响动物生产及人类健康,因此准确检测饲料、食品中大豆凝集素的含量具有重要意义。虽然检测大豆凝集素的方法很多,但是都存在着一定的缺陷,不能对具有生物学活性的大豆凝集素完全定量,而试剂盒价格昂贵,且只能检测具有免疫学活性的大豆凝集素。本研究通过制备抗SBA单克隆抗体,根据其能凝集红细胞的特性,建立了快速、准确、稳定的检测大豆凝集素含量的功能性ELISA法。试验以高纯度的大豆凝集素为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠；第三次免疫后取阳性血清,建立了间接酶联免疫吸附法,确定包被抗原最适工作浓度为8μg／ml,抗血清最适工作浓度为1：8000,并用建立的ELISA方法检测抗血清及细胞培养上清液抗体效价；经过加强免疫后,免疫小鼠血清效价均达到6.4×104,可以用于细胞融合试验；利用细胞融合技术,采用聚乙二醇融合法融合免疫脾细胞和SP2／0瘤细胞,融合率达80%,阳性率达到31%；利用杂交瘤细胞克隆筛选技术,采用有限稀释法经过4次克隆,筛选出2株能够稳定分泌抗大豆凝集素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为A7、F12。经检测2株细胞培养上清抗体效价分别为1：2×103、1：3×103,腹水效价均为1：1×106；间接ELISA方法测得A7、F12单克隆抗体亲和常数分别为4.88x107mol／L和7.1×107mo1／L；经鉴定2株细胞分泌的单克隆抗体均为IgG2b型。试验通过抗原抗体亲和层析法获得了纯度较高的IgG2b型单克隆抗体；经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定F12细胞株分泌的单克隆抗体分子量为189.6KDa,其中轻链分子量为24.1KDa,重链分子量为70.7KDa; Western blotting检测结果表明两株单克隆抗体与大豆中其他蛋白呈现较弱的交叉反应,对大豆中大豆凝集素有较高的特异性,可以应用于免疫试验中。本试验选择对大豆凝集素有较高敏感性的兔红细胞外壳捕获待测品中具有凝集活性的大豆凝集素。将兔红细胞外壳包被于酶标板,捕获待检大豆凝集素,以纯化获得的大豆凝集素为标准品,制备的单克隆抗体为一抗,羊抗鼠酶标抗体为二抗,绘制大豆凝集素浓度标准曲线,建立功能性ELISA检测待测样品中具有生物学活性的大豆凝集素含量。试验确定了兔红细胞膜的最适包被浓度为8μg/mL,单克隆抗体最适工作浓度为1：2000,大豆凝集素标准品浓度在0.01-10μg/mL时有较好的线性关系,在此范围内建立了大豆凝集素浓度标准曲线。应用建立的功能ELISA方法对同一样品进行多次测定,结果表明,建立的功能ELISA方法具有较高的特异性和重复性。