Ⅰ型菊酯类农残通用单克隆抗体研制与快速检测技术研究

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拟除虫菊酯是一类在天然菊酯结构基础上发展而来的仿生药物,被广泛应用于农业林业畜牧业和家庭卫生中病虫害的防治拟除虫菊酯的大量暴露,会危害人类的免疫系统或诱发细胞癌变鉴于其危害,世界各国对农产品食品中拟除虫菊酯限量都有严格规定,从而导致我国出口农产品时因菊酯类农残超标而产生贸易摩擦,为我国经济带来了很多负面影响因此,建立准确灵敏快速的检测技术是当务之急免疫分析技术作为一种快速筛查手段已被广泛应用于农药等小分子物质的检测目前,国内外对于农药小分子的免疫分析大多集中针对单个农药小分子进行抗原设计和单克隆抗体的制备,即一种抗体只对单一的目标化合物即针对单一农药残留进行检测,在实际应用中往往需要对样品基质中的多种农药残留进行测定,即进行多组分残留分析本研究针对以上关键技术难题进行研究,主要研究内容和创新点如下:1.首次选育获得两株分泌抗型拟除虫菊酯农药抗体的阳性杂交瘤细胞株利用实验室自主合成的型拟除虫菊酯通用型抗原免疫小鼠,通过半固体培养-梯度筛选法,最终获得两株能稳定分泌抗型拟除虫菊酯抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为Pyr1C5Pyr3C82.首次研制出两种抗醚菊酯氯菊酯和苯醚菊酯广谱型单克隆抗体,并进行参数表征结果表明,两株单克隆抗体均为lgG1型,Pyr1C5与Pyr3C8两株单克隆抗体的亲和力常数分别为2.16×108L/moL和8.5×108L/moL属于高亲和力抗体,可适用于免疫分析方法的研究Pyr1C5抗体与醚菊酯氯菊酯和苯醚菊酯的交叉反应分别为100%82.2%和67.3%, Pyr3c8抗体对醚菊酯的灵敏度(IC50)为0.0552μg/mL,与氯菊酯和苯醚菊酯的交叉反应分别为84.3%和71.7%两种抗体对其他型和型拟除虫菊酯菊酯的交叉反应率均小于1%3.以单克隆抗体Pyr3C8为基础,研究建立了检测醚菊酯氯菊酯和苯醚菊酯总量的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ELISA)在优化条件下,Pyr3C8抗体对醚菊酯的灵敏度(IC50)为20.86μg/L,线性范围:6.32~169.14μg/L,方法最低检出限:3.16μg/L;抗体对氯菊酯的IC50值为24.2μg/L,线性范围:6.19-478.0μg/L,最低检出限:3.72μg/L;抗体对苯醚菊酯的IC50值为29.4μg/L,线性范围:6.37-404.0μg/L,最低检出限:4.27μg/L将该方法应用于样品中醚菊酯氯菊酯和苯醚菊酯的混合加标回收检测,加标回收率在81%-95%之间,相对标准偏差在3.1%-7.2%之间将该方法用于实际样品检测,并与国家标准方法GC-MS方法进行比对,测定结果具有良好的一致性(R2=0.973)4.首次研究建立了基于时间分辨荧光的醚菊酯免疫层析定量分析方法构建了时间分辨荧光免疫层系分析模型,率先研制出醚菊酯高灵敏时间分辨荧光试纸条,其对醚菊酯的定量检测限为9.12ng/mL,将试纸条应用与15份农产品中醚菊酯残留水平的检测,并与建立的定量ELISA方法进行结果比对,两种方法的结果符合相关系数达到0.986(R2)
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