环境纳米污染物对质粒介导的抗生素抗性基因水平转移的影响及机理研究

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质粒介导的抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)的水平转移对全球公共卫生构成重大威胁,成为环境领域研究的热点。在近年的研究中,各种环境介质中ARGs被频繁检出,其对人类健康造成重大影响。ARGs主要以质粒作为携带载体,并由特定基因编码的蛋白通道在相同甚至不同种属的细菌之间发生基因水平转移,从而导致抗性基因在环境中的传播扩散。纳米污染物在环境中普遍存在,主要包括天然的和人工纳米颗粒物两大类。天然纳米胶体(Natural nanocolloids,NCs)是指粒径为1~1000 nm的微粒,相比于大尺度的胶体物质,小于100 nm的NCs具有高的反应活性和吸附性能,可影响多种环境污染物的迁移和转化行为。因此,环境中普遍存在的NCs是否能够对ARGs的水平转移产生影响值得研究。与此同时,单层二硫化钼(MoS2)是一类新兴的类石墨烯二维纳米材料,其在环境领域的广泛应用将不可避免的释放到环境中,然而MoS2进入环境是否会影响ARGs的传播扩散尚不清楚。本研究以水体环境为介质,富集自然水体环境中的NCs,构建水体微观体系,探究NCs对水体环境中质粒介导的ARGs水平接合转移的影响及机理;以土壤为介质,研究MoS2暴露对土壤环境中ARGs基因丰度的影响;进一步构建土壤微环境体系,深入分析MoS2对土壤环境中RP4质粒介导的ARGs水平转移的影响及分子机理。(1)在水环境体系中,NCs的暴露抑制RP4质粒水平接合转移,并且随着NCs浓度的增加(1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L),接合子数量分别为7.8×10~3、3.9×10~3、1.2×10~3,接合频率倍数分别为对照组的2.141、4.395和13.91倍。细胞膜通透性性降低但变化不明显;NCs(5 mg/L,10 mg/L)时的活性氧自由基(ROS)含量显著下降10倍、31.6倍;NCs(10 mg/L)时,谷胱甘肽(GSH)水平减少2.32倍;超氧化物歧化酶(SOD)没有显著变化;胞外分泌的多糖浓度含量降低29.3%;细菌粘附力降低50%;ATP水平降低40.2%。代谢组学结果表明,NCs可显著抑制微生物脂肪酸代谢(十六碳烯酸和十六烷酸等)和氨基酸代谢(谷氨酸,丙氨酸,天冬氨酸,赖氨酸,精氨酸,脯氨酸)过程,抑制ROS和SOD相关代谢产物的合成;NCs暴露时,三羧酸循环(TCA)通路显著下调,ATP合成受阻。转录组学结果表明,10 mg/L的NCs暴露时,细菌膜蛋白表达基因(ycg I,art M,sap C,ugp A,ycj O,cys U,pro W,his P)显著下调,阻碍供体菌和受体菌之间的接合。同时脂多糖代谢基因(waa G,lpx T)以及粘附蛋白基因(yad K,yad N,yde R,yfc V)也显著下调,使得胞外聚合物(EPS)的合成被抑制,导致细菌粘附力下降,从而降低RP4质粒的水平接合转移。(2)土壤原位暴露结果表明,25 mg/kg的MoS2暴露45天后,bla TEM、sul 2基因的丰度显著升高,相比于空白提高了约3.2倍、1.5倍。与此同时,位于染色体上的基因erm F、erm B丰度无显著变化。上述研究结果表明,MoS2可显著促进基因移动元件介导的ARGs水平转移。在无菌土壤接合转移体系中,不同浓度(5,10,25 mg/kg)的MoS2的接合转移频率分别是空白处理组的1.54倍,1.71倍,1.42倍。表明MoS2可显著促进抗性质粒的水平转移。(3)体外实验发现,MoS2(5mg/L、10 mg/L和25 mg/L)使接合子数量增加约1.56-1.67倍,细菌的细胞膜通透性无明显变化,细菌粘附力提高1.3-1.6倍,同时ROS水平显著降低42.5%。处理组(10和25 mg/L)MoS2可分别提高ATP水平40.6%、23.2%。转录组学结果表明,MoS2通过上调glc F,glx R,ttd B,glc E等代谢基因的表达,促进能量代谢过程中ATP的合成;与此同时,MoS2通过上调细胞分泌蛋白相关基因(gsp C,fli P,gsp H)的表达,促进细菌EPS的合成,增强细胞间粘附力,从而促进质粒RP4在土壤模拟环境中的水平接合转移。
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