一、研究背景肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)在我国也被称作流行性出血热(Epidemic hemorrhagic fever，EHF)，是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起的在临床上以高热、出血和肾功能损害为特征，严重危害人类健康的自然疫源性疾病。中国是世界上HFRS发病最高的国家，累计发病100多万，每年报告病例占全球90％以上，疫区发病率在3.5／10万左右，流行期间病死率高达30％，该病在我国分布范围广、疫区类型复杂，已成为危害人民健康和生命安全的重点传染病之一。山东省1962年在济宁鱼台县发现首例病人，随后病例散在发生，1975年后疫情呈逐年上升趋势，1986年发病达最高峰，全年报告发病41443人，发病率为53.69／10万，约占当年全国总报告发病人数的50％。之后，我省HFRS报告发病人数，一直居全国首位，总发病人数占全国发病人数的1／3。HFRS在山东每隔10年左右出现一次流行高峰，前两次流行高峰分别出现在1986年和1995年。按照此规律，下一个流行高峰可能会在近年出现。研究表明近几年来山东省HFRS发病开始出现一些波动，进入不稳定期。因此有必要对山东省HFRS流行病学特征进行调查，并在此基础上对HV分离株基因变异情况等进行研究，这将对该病的有效预防与控制具有重要的意义。二、研究目的1．阐明山东省1994-2006年HFRS发病和死亡病例的时间、地点和人群分布特征。2．分析山东省HFRS宿主动物的种类构成、生态学特征、小兽密度和带毒情况。3．分析山东省HV核苷酸序列特征及其进化关系，HV亚型分布及其与其它毒株的基因同源性。4．探讨HV快速诊断和基因分型方法。三、研究方法1．人间疫情分析山东省1994-2006年HFRS疫情数据来自山东省疾病预防控制中心(CDC)疫情报告资料，利用Excel软件进行统计分析，绘制折线图和柱状图，利用地理信息系统(Geographic information systems，GIS)绘制发病和死亡分布图。2．宿主动物分析山东省1994-2006年各固定监测点和游动监测点小兽密度、小兽种类构成和各小兽的带毒率监测资料来自山东省HFRS监测点的宿主动物流行病学和病原学监测结果，血清学和病原学检测在山东省CDC的HFRS实验室完成。利用Excel和SPSS11.5软件对相关指标进行统计分析，计算小兽密度、种群构成、群落空间分布和感染病毒情况。3．分子流行病学研究3．1鼠肺和部分病人血清HV抗原检测利用间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescent assay, IFA)检测。3．2部分病人血清HV IgM抗体检测利用IgM捕获ELISA法(MacELISA)。3．3 RNA提取利用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病人血清和经IFA检测为阳性鼠肺的总RNA。3．4逆转录套式PCR(Reverse transcription nested PCR，RT Nested PCR)将提取的总RNA逆转录成cDNA，根据HV基因M片段G2区保守序列合成1对通用外引物和两对型特异性引物，首先以合成的cDNA为模板，利用通用外引物进行第一次PCR反应，然后以其产物为模板，分别用两对型特异性引物进行第二次PCR反应。3．5序列测定将第二次PCR产物利用试剂盒回收，回收产物送上海英俊生物技术有限公司和上海生工生物工程技术服务公司利用377DNA测序仪器进行序列测定。3．6同源性分析与系统发生树研究利用DNASTAR软件将测序所得序列和山东以往HV序列以及国、内外其它地区HV序列进行同源性分析及系统发生树分析。根据系统发生树分析结果，将所有山东地区HV序列按亚型在山东省地形图上进行标注、分析。将山东省鼠源毒株序列和人源毒株序列分别进行同源性比较，采用t检验将其同源性数据进行统计分析。3．7 PCR／SSCP根据汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)HTN76-118株和汉城病毒(Seoul virus，SEOV)SR-11株S基因片段序列资料设计互补于S基因片段的一对寡核苷酸引物(内、外引物各一对)，对从病人血清中提取的总RNA利用内、外引物进行PCR反应，将第二次PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism，SSCP)分析。四、主要研究结果1．人间疫情1994-2006年山东省HFRS发病呈现下降趋势，发病和死亡都有明显的春季和秋冬季高峰，近年来发病和死亡秋峰略有升高且出现时间略有提前，自2003年起病死率明显上升，2005年达到1.11％。山东省HFRS主要发生在鲁中南山区，2001-2006年与1994-2000年相比，鲁东南丘陵地区所占比例有所增加，鲁西北平原所占比例则明显下降。1995-2006年山东省HFRS发病男性占67.21％，女性占32.79％，性别比例为2.05：1；死亡病例中男性占71.82％，女性占28.18％，性别比例为2.55：1，近年来男性发病稍有增高，而女性死亡有所增高。山东省HFRS以20-59岁人群发病为高，占全部发病的79.61％，近年来50岁以上年龄组人群发病和死亡所占比例升高。各种职业中，农民发病和死亡最多，分别占81.55％和82.84％。2．宿主动物1994-2006年山东省居民区主要以褐家鼠(59.58％)和小家鼠(32.39％)为优势鼠种，野外主要以黑线姬鼠(32.39％)、褐家鼠(26.65％)和大仓鼠(22.68％)为优势鼠种，居民区和野外鼠种构成有显著性差异(χ~2=3356.588，P=0.000)。分1994-2000和2001-2006时间段来看，2001-2006年居民区小家鼠所占比例上升，褐家鼠下降，而野外黑线姬鼠比例下降，褐家鼠比例上升。从生态群落空间分布来看，鲁中南山区群落的多样性(0.6870)最高，鲁东南丘陵地区群落的均匀度(0.7038)最高，胶莱平原的多样性(0.4337)和均匀度(0.4949)均最低。1994-2006年共检测9种9848只动物，肺HV抗原阳性318只，小兽带毒率为3.23％，其中褐家鼠225只，占70.75％；小家鼠42只，占13.21％；黑线姬鼠29只，占9.12％；大仓鼠10只，占3.14％；背纹仓鼠和鼩鼱各6只，各占1.89％。1994-2006年居民区与野外鼠带毒率有显著性差异(χ~2=11.147，P=0.001)。小兽密度、小兽带毒率和带毒指数的季节性比较强，随着季节的变化而上下波动，其中有春季和秋季两个高峰。1994-2006年小兽密度3月和9月比较高，分别达2.97％和3.23％，形成两个高峰。1994-2000年小兽带毒率春峰比较明显，高达5.61％，秋冬峰不明显；2001-2006年春峰和秋冬峰均较明显，分别为5.98％和5.94％。3．HV分子流行病学研究结果3．1 IFA共检测鼠肺标本572份，其中20份HV抗原阳性，2份来自黑线姬鼠，其余18份均来自褐家鼠。3．2 MacELISA 48份病人血清经检测，35份阳性，阳性率为72.92％。3．3 RT Nested PCR 23份HFRS患者的血清中，15份扩增结果为阳性，2份只被HTN型引物扩增，13份只被SEO型引物扩增。20份经IFA检测为阳性的鼠肺经扩增后，16份为阳性，其中1份黑线姬鼠鼠肺只被HP1、HP2扩增，15份褐家鼠鼠肺只被SP1、SP2扩增。HTN型片段大小约为383bp，SEO型片段大小约为418bp。3．4序列测定结果经测序获得22株HV部分核苷酸序列(2003nt-2302nt)，其中11株来自HFRS病人血清，1株为HTN型，10株为SEO型；11株来自褐家鼠鼠肺，均为SEO型。3．5序列分析结果1984-2006年山东省HV同源性在67.1％～100％之间，HTN型HV的同源性在78.1％～98.7％之间，SEO型HV的同源性在93.7％～100％之间。山东省HTN型HV至少存在H2、H5、H9三个亚型，没有优势亚型，SEO型至少存在S2、S3两个亚型，S3为优势亚型，其中实验分离株SDP2和SDP12均为新发现亚型H5亚型和S2亚型。山东省人源和鼠源SEOV的同源性经t检验有统计学意义(人源SEOV：96.89％±1.64％；鼠源SEOV：97.92％±1.11％。t=-3.02，P=0.003)。山东省HV亚型分布具有一定的地理聚集性，鲁中南山区HV亚型分布最复杂。3．6 PCR／SSCP结果48份HFRS病人血清经RT Nested PCR扩增得到41份阳性结果，其中发病1周内血清扩增阳性率为100％。PCR产物经SSCP分析，呈现2种不同的图谱：33份具有相同的SSCP图谱，与标准株R22株相同，属SEO型；而另8份则与HTN76-118株具有相同的SSCP图谱，属HTN型。五、结论1．1994-2006年山东省HFRS发病呈现下降趋势，秋季发病相对增多，从2003年开始病死率明显上升。HFRS高发区逐渐由鲁西北向鲁东南移动。HFRS50岁以上年龄组发病和死亡所占比例升高，女性死亡病例增多。2．1994-2006年山东省居民区内小家鼠所占比例升高，褐家鼠下降，而野外黑线姬鼠比例下降，褐家鼠比例上升。鲁中南山区小兽群落多样性最高，鲁东南丘陵地区均匀性最高。居民区与野外小兽带毒率差异显著，春季和秋冬季带毒率均有不同程度升高。3．山东省HFRS疫区是以家鼠型为主的家鼠型和姬鼠型混合型疫区，HTN型HV至少存在H2、H5、H9三个亚型，SEO型HV至少存在S2、S3两个亚型，H5亚型和S2亚型为首次在山东省发现。山东省HTN型HV亚型较分散，没有优势亚型，而SEO型HV的亚型主要集中于S3亚型。4．山东省HTN型HV变异比SEO型大，SEO型HV在相对稳定遗传的基础上也在持续不断变异，人源SEOV的同源性比鼠源SEOV的同源性低。山东省HV亚型分布具有一定的地理聚集性，鲁中南山区HV亚型分布最复杂。5．RT-Nested PCR用于HFRS患者早期血清标本的检测阳性率较之MacELISA高，特别对1周内的血清，阳性率可达100％。RT-Nested PCR结合SSCP法可应用于HV分型，操作简便、迅速，可一次分析大量标本，值得对其进一步研究。六、意义和创新本研究描述了山东省1994-2006年HFRS的三间分布和宿主动物特征，揭示了HFRS流行现况的动态变化。研究了山东省HV核苷酸序列特征及其进化关系，首次报道山东省HV存在H5亚型和S2亚型，并证明山东省人源SEOV的同源性比鼠源SEOV的同源性低。对RT-Nested PCR结合SSCP法应用于HFRS诊断和HV分型进行了研究，该方法操作简便、迅速，值得对其进行进一步的研究。