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花瓣衰老是植物生命周期的最后发育阶段,表现为花瓣萎蔫或脱落、花色改变、花径变小等特征,涉及一系列生理代谢过程,是基因表达、蛋白质合成以及内外因素综合调控的结果。前人在大丽花花瓣蛋白质组研究中已分离、鉴定了多种花瓣衰老相关的差异表达蛋白质,主要涉及乙烯合成、花色素合成以及细胞壁修饰等生理功能,并且已克隆了2个大丽花木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因(Dp XTH1和Dp XTH2),但对它们在转录水平上的表达特征还缺少研究和了解。本研究以大丽花‘单瓣黄’品种为试验材料,利用基因克隆技术,克隆了大丽花花瓣衰老相关基因;应用生物信息学方法,探讨了基因结构与进化关系;利用实时荧光定量PCR技术,分析不同发育阶段、不同外源激素处理条件下大丽花花瓣衰老相关基因的表达特征,主要实验结果如下:1.应用分子生物学及生物信息学技术,从大丽花花瓣中克隆了CHS、ANS和CHI基因的c DNA序列,分别命名为Dp CHS、Dp ANS和Dp CHI。Dp CHS基因的编码区序列为1170 bp,编码389个氨基酸残基和1个终止密码子;Dp ANS基因的编码区序列为1068 bp,编码355个氨基酸残基和1个终止密码子;Dp CHI基因的编码区序列为675 bp,编码224个氨基酸残基和1个终止密码子。Blast分析结果表明,Dp CHS、Dp ANS和Dp CHI均与大丽花栽培品种Michael J的同源性最高为99%。聚类分析结果表明,Dp CHS、Dp ANS、Dp CHI与已报导的多种菊科植物亲缘关系最近,都分别聚为同一组,基于氨基酸序列的系统进化树与植物亲缘关系的进化基本一致,同科植物在进化上处于同一分支。2.应用分子生物学及生物信息学技术,分别以向日葵SAMS序列(Gen Bank JN561248.1)和菊花ETR序列(Gen Bank:AF547624.1)为原始核酸序列,电子克隆了SAMS及ETR基因的c DNA编码区序列。分别在该序列的保守区域设计简并引物,从大丽花花瓣中克隆了SAMS、ETR基因的c DNA部分序列,分别命名为Dp SAMS和Dp ETR。Dp SAMS基因片段大小为163 bp,编码54个氨基酸残基;Dp ETR基因片段大小为118 bp,编码39个氨基酸残基。Blast分析结果表明,Dp SAMS在100条比对结果中同源性在83-96%之间,其中与向日葵的同源性最高为96%;Dp ETR在100条比对结果中同源性在71-91%之间,其中与菊花的同源性最高为91%。3.从自然生长状态下大丽花现蕾期、初花期、盛花期和衰败期的花瓣中提取RNA,反转录合成c DNA,设计Dp CHS、Dp ANS、Dp CHI、Dp SAMS和Dp ETR基因的实时定量PCR特异引物,以β-actin为内参基因进行实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析,结果表明Dp CHS、Dp ANS和Dp ETR基因转录水平上的表达量均呈先上升后下降的趋势,即从初花期开始积累,至盛花期达到峰值,到衰败期又下降;Dp CHI的转录水平呈逐渐下降的趋势,即现蕾期的表达量最高,随后逐渐降低;Dp SAMS的表达量呈逐渐上升的趋势,至衰败期达到峰值。初步判定Dp CHS、Dp ANS、Dp ETR和Dp SAMS为大丽花花瓣衰老相关基因,而Dp CHI为大丽花花瓣衰老下调基因。·4.采用乙烯利(ETH)、1-甲基环丙烯(MCP)为外源激素,对大丽花初花期的花瓣进行“在体处理”,以不作任何处理为对照区,分别处理0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后,提取各试验区花瓣的RNA进行q RT-PCR分析。结果表明,在处理期间内,Dp CHI、Dp SAMS、Dp ETR、Dp XTH1和Dp XTH2的表达量总体上均呈先上升后下降的变化趋势;其中在对照区和ETH处理区,Dp CHS和Dp ANS表达量表现为上升后下降,而MCP处理区呈逐渐上升趋势;与对照区相比,在ETH处理的花瓣中,衰老相关基因的表达量较高,且较早检测到峰值,而MCP处理则降低了表达量,且推迟了峰值出现的时间,说明外源乙烯和MCP处理可以调控大丽花花瓣的衰老进程,并且其调控作用与上述基因的表达变化有关。5.采用乙烯利(ETH)、1-甲基环丙烯(MCP)为外源激素,分别对大丽花现蕾期、初花期、盛花期的花瓣进行“在体处理”12 h,以不作任何处理为对照区,提取各试验区花瓣的RNA进行q RT-PCR分析。结果表明,在初花期经ETH处理12 h后的花瓣中,检测到Dp CHS、Dp ANS、Dp ETR、Dp XTH1和Dp XTH2基因的表达量峰值,而Dp CHI表达量峰值出现在现蕾期,Dp SAMS的表达量峰值出现在盛花期;就不同基因而言,Dp CHI的表达量峰值出现最早,其次是Dp CHS、Dp ANS、Dp ETR、Dp XTH1和Dp XTH2,最后是Dp SAMS;与对照区相比,ETH处理显著增加了Dp SAMS和Dp ETR的转录水平,而MCP处理则抑制了其表达。以上实验结果进一步说明外源激素处理可以影响相关基因的转录水平,并且基因转录水平的调节与花瓣处理时期有关,在初花期施用MCP处理效果最为明显,可以延缓花瓣的衰老进程,从而延长大丽花的观赏期。