钙磷降解材料生物矿化的细胞分子生物学基础研究

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生物医用材料是材料科学技术的一个分支,相关研究涉及生物医学领域中最基本的科学问题。为了探讨无生命的物质参与构建有生命组织的机制,开展了钙磷降解材料生物矿化的细胞分子生物学基础研究。 设计并建立了细胞培养→基因克隆→基因表达→蛋白质纯化→蛋白质分子与材料作用的系统研究模式。首先采用酶消化法和植块法从Wistar乳鼠颅骨体外分离培养了大鼠成骨细胞,两种方法获得的成骨细胞经传代培养和纯化后,显示出高的碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力,具有良好的生物学特性。将原代培养后传至第3代、经过纯化、状态良好的成骨细胞进行冻存,复苏后存活率达93%,碱性磷酸酶染色呈强阳性,有钙结节形成,可扩增碱性磷酸酶基因,与未冻存细胞比较,复苏细胞的生物学特性无明显改变; 设计了一对PCR反应特异性引物F1、R1,从酶消化法分离培养的Wistar乳鼠成骨细胞总RNA中扩增出骨粘连蛋白的编码区cDNA序列,将PCR产物插入pBS-T载体,测序并与GenBank核酸数据库比对,其序列与GenBank核酸数据库中收录的一致; 将大鼠骨粘连蛋白基因重组到原核表达载体pGEX-KG中,构建了正确的表达载体pGEX-KG/ON,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中实现了全长表达,表达的融合蛋白存在于细菌裂解液上清中,上清中的目的蛋白采用硫酸铵分级沉淀、超滤膜分离、GST亲和层析逐步纯化,获得了高纯度的大鼠骨粘连蛋白; 将大鼠成骨细胞与钙磷材料混合培养,显微镜下可观察到成骨细胞对钙磷材料有明显的吞噬作用;细胞计数、MTT和CKK-8等实验结果表明,钙磷材料有利于成骨细胞增殖; 将骨粘连蛋白与Ca2+离子作用,采用等离子体发射光谱仪进行检测,证明所获得的骨粘连蛋白可结合钙离子;骨粘连蛋白与钙磷材料作用后,SEM、XRD、XPS测试结果显示,蛋白在钙磷材料表面发生了吸附和键合反应。骨粘连蛋白通过Ca2+离子结合位点结合Ca2+,通过-NH3+结合PO43-,并启动羟基磷灰石晶核形成,以高的亲和力吸附羟基磷灰石晶核后,从材料表面解吸,通过胶原结合位点在胶原纤维上吸附,实现其结合钙/磷、转运钙/磷、结合胶原蛋白的功能,引导钙盐在基质中沉积和骨的矿化。
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