论文部分内容阅读
杨梅是我国特色果树,果实风味独特,色泽鲜艳,汁液多,营养和药用价值高,对人体有重要的医疗保健作用。为全面了解杨梅果实成熟与品质形成机制,开展了杨梅果实EST研究,获得了以下主要结果。(1)构建了杨梅果实四个成熟度cDNA文库应用改良Bugos法以绿色未成熟、转色初熟、红色成熟、暗红色完熟“荸荠”杨梅果实为试材,提取总RNA,应用polyAT技术分离纯化mRNA,利用LD-PCR技术合成cDNA,经SfiⅠ酶切后克隆入pDNR-LIB载体,构建了杨梅四个成熟度果实cDNA文库。文库滴度分别为1.18×10~6 cfu/ml、3.92×10~5 cfu/ml、1.49×10~5cfu/ml和2.01×10~5 cfu/ml,文库的重组率分别为94.74%、94.74%、100%和94.74%,插入片段长度在300 bp-1000 bp之间,表明文库质量较高。(2)构建了包含2000个克隆序列的EST文库分别从四个cDNA文库随机挑取500个克隆进行测序,共获得2000个EST序列,分析表明,共有395个Unigene序列。将Unigene序列与Uniprot数据库进行比对,具有同源序列的Ungene共315条,占Unigene总数的79.75%。将Unigene进行功能基因归类,发现参与抗病、抗逆过程的防御性基因占总Unigene的14.18%,说明杨梅果实成熟期间抗逆防御体系运转加强。鉴定出ACC氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶等成熟相关基因以及类甜蛋白、MYB转录因子等果实品质形成相关基因。(3)构建了用于筛选高频基因的MPCR体系EST分析结果表明,类金属硫蛋白3、类甜蛋白等10个基因的丰度较高,占总文库的1.55%-20.4%,10个基因丰度总计为57.00%。依据高频基因序列分别设计引物,构建了用于筛选这10个高频基因的MPCR体系。应用已测序克隆,验证了这一体系的有效性。