烟草AOC与COI1基因沉默材料的创制及其抗赤星病和黑胫病的室内评价

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烟草赤星病和黑胫病是在栽培烟草种植过程中危害最为严重的两大主要侵染性烟草病害。实验室前期的结果表明,在赤星病菌(链格孢菌)和黑胫病菌(黑胫病1号小种)接种烟草后,不论是在野生渐狭叶烟草还是在栽培烟草中,均可以诱导植物体内合成植物激素茉莉酸,但是茉莉酸是否在宿主植物烟草抵御这两种病害中起作用目前仍然未知。为了证明茉莉酸在烟草抗病中的作用,我们以栽培烟草K326(Nicotiana tabacum)为材料,运用RNAi技术,成功创制了茉莉酸的关键合成酶基因AOC与受体基因COI1沉默的转基因植物,并评价了基因沉默植物AOC-RNAi株系和COI1-RNAi株系对赤星病和黑胫病的抗病性。主要结果如下:1)激光共聚焦显微镜研究表明,接种链格孢菌24 h后,一些链格孢菌菌丝会通过气孔侵入栽培烟草K326的叶片组织;2)栽培烟草K326在感染赤星病菌和黑胫病菌后,茉莉酸水平显著性升高,而且通过荧光定量PCR分析结果显示,茉莉酸信号途径相关基因的表达水平上调;3)本实验成功运用RNAi技术来创制了茉莉酸关键合成酶丙二烯氧化环化酶的基因AOC和茉莉酸受体基因COI1被有效沉默的T2代纯合AOC-RNAi株系和COI1-RNAi株系沉默效率分别为74%和52%;4)荧光定量PCR分析和激素水平测定结果表明,AOC-RNAi株系中,赤星病诱导的AOC基因表达水平和茉莉酸水平均显著性下降;5)COI1-RNAi株系不仅表现出COI1基因表达水平被明显抑制,而且对外源茉莉酸甲酯诱导的根抑制生长表型不明显,证明了 COI1基因被成功沉默;6)在COI1-RNAi植物中,不仅赤星病菌诱导的茉莉酸合成酶基因AOC的表达有非常显著性的降低,而且赤星病菌诱导的转录因子基因NAC90、bHLH92、MYB4、WRKY50以及植保素scopoletin的合成酶基因F6’H1的表达也显著性的降低,表明茉莉酸信号可能通过这些基因的表达来调控栽培烟草对赤星病菌的抗病性;7)接菌实验后的抗病性评价表明,AOC-RNAi株系和COI1-RNAi株系更易感染赤星病菌和黑胫病菌,证明了茉莉酸在宿主植物抵御这两种病害中起着重要的作用。综上,本论文利用了 RNAi技术创制了茉莉酸合成与受体基因沉默的栽培烟草转基因植物,并利用这些植物证明了茉莉酸信号通路作为重要的抗赤星病菌信号在栽培烟草和野生渐狭叶烟草植物中的保守性,还首次发现了茉莉酸信号通路在栽培烟草抗黑胫病菌中的关键作用。
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