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annexinⅡ在DNA合成及细胞增殖等方面起重要作用,在多种恶性肿瘤组织中表达量明显增高,且与恶性程度、预后、局部侵袭及转移相关,选择性抑制annexinⅡ基因的表达将可能抑制肿瘤细胞的增殖,降低其对周围组织的侵袭及转移,为肺癌基因治疗提供新靶点。本研究应用RT-PCR及电泳条带光密度比较法分析了annexinⅡ基因mRNA在肺癌组织中的表达情况;通过PCR扩增获得annexinⅡ的部分基因序列,并将其反向克隆到反转录病毒载体pLXSN的多克隆位点上,构建了annexinⅡ基因反义RNA的表达载体,并将其转染人肺腺癌细胞株SPC-A-1,以抑制annexinⅡ基因表达;观察反义RNA对SPC-A-1细胞生物学行为的影响;通过裸鼠成瘤实验观察SPC-A-1细胞转染前后annexinⅡ表达变化对整体水平的影响,从而为肺癌基因治疗提供理论依据。方法:(1)用RT-PCR法检测肺癌组织与癌旁正常肺组织中annexinⅡ基因mRNA的表达量。(2)提取SPC-A-1细胞总RNA,根据人annexinⅡ基因mRNA序列设计引物,应用RT-PCR法扩增目的片断,通过双酶切定向克隆的方法构建annexinⅡ基因反义表达载体。(3)应用脂质体将反义表达载体导入SPC-A-1细胞,用G418筛选阳性克隆,用PCR法证实转染是否成功,用RT-PCR法检测转染前后细胞annexinⅡ基因mRNA表达差异。(4)分别用细胞生长曲线、平板克隆形成实验、3H-TdR掺入实验及测定细胞周期观察细胞增殖方面的改变;用原位细胞凋亡法检测细胞凋亡情况;将转染前后的细胞分别接种裸小鼠,观察其在整体水平的生物学效应。结果:(1)人肺癌组织中annexinⅡmRNA表达量显著高于癌旁正常肺组织。(2)经过平板筛选、酶切及测序鉴定,插入片断与annexinⅡmRNA同源性99.6%,证实我们成功构建了annexinⅡ基因反义表达载体。(3)经脂质体转染及G418筛选,反义组及空载体组均有阳性克隆形成,用PCR法证实两种载体均成功整合到细胞基因组DNA中;用RT-PCR法证实反义组细胞中annexinⅡmRNA表达量较亲代细胞下降约三分之二。(4)对转染前后的细胞观察表明,反义组细胞生长减慢,克隆形成率降低,3H-TdR掺入率下降,细胞增殖被阻滞于G0-G1期,凋亡率与亲代细胞相比无显著差异;裸鼠成瘤实验表明,反义组接种后形成的肿瘤体积、重量均显著低于亲代组,且无一例出现局部侵犯,而亲代组则<WP=8>有二例侵犯周围组织。结论:(1)与癌旁正常肺组织相比,人肺癌组织中annexinⅡmRNA的表达量明显增加。(2)成功构建了人肺腺癌annexinⅡ基因的反义表达载体。(3)应用脂质体转染法成功地将annexinⅡ基因的反义表达载体导入SPC-A-1细胞,并整合至细胞基因组中;反义表达载体显著抑制了annexinⅡmRNA的表达。(4)反义表达载体能够显著抑制肺癌细胞增殖及移植瘤的生长,降低瘤细胞对周围组织的侵袭作用。