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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是临床常见的神经退行性疾病,其主要病理学特征表现为黑质致密带的多巴胺能神经元缺失、纹状体多巴胺释放减少、残存神经元内出现以α-突触核蛋白（alpha synuclein,α-syn）为主要成分的路易小体以及黑质区的铁异常沉积等。近年来,关于脑铁代谢异常诱发PD黑质多巴胺能神经元退变的研究逐渐受到关注。溶酶体是细胞内重要的储铁细胞器,转录因子EB（Transcription Factor EB,TFEB）是溶酶体再生的主要调控因子,参与调控自噬小体与溶酶体的融合过程。研究报道,敲除Tfeb的细胞内活性氧水平升高,且对Erastin诱导的铁死亡更加敏感。值得注意的是,现有的研究大多关注于TFEB调节自噬,而TFEB能否调节铁代谢,尚未有研究报道。本研究拟从TFEB调节铁代谢的作用与机制入手,探讨TFEB在铁死亡中的作用和可能机。方法:在PC12细胞上分别过表达/干扰TFEB,通过Lyso Tracker标定和追踪细胞内的溶酶体,免疫印迹、免疫荧光检测自噬-溶酶体途径相关蛋白与铁代谢相关蛋白表达变化,Fe Rho Nox TM-1观察Fe2+变化,Calcein AM与Fe SO4灌流实验观察细胞摄铁速率;免疫荧光染色与激光共聚焦显微镜相结合,并采用Scatter Plot分析转铁蛋白受体1（transferrin receptor,Tf R1）和Lamp1的共定位情况（Pearson’s系数可提示Tf R1与Lamp1共定位的相关性）;通过给予枸橼酸铁铵（Ferric ammonium citrate,FAC）模拟铁超载环境,继而通过Fe Rho Nox TM-1观察Fe2+变化,免疫印迹检测铁代谢相关蛋白表达;给予铁死亡诱导剂Erastin（10μM）处理24 h,通过倒置荧光显微镜观察细胞生长及存活情况,并检测铁代谢相关蛋白变化。结果:1.高表达TFEB可上调铁代谢相关蛋白（Tf R1、FTL和FTH）的表达水平与Lv-GFP组相比,Lv-TFEB组细胞中Tf R1、铁蛋白轻链（Ferritin-Light chain,FTL）和铁蛋白重链（Ferritin-Heavy chain,FTH）表达均增加（P＜0.05）,提示TFEB可参与调控铁代谢相关蛋白。2.高表达TFEB可降低细胞内游离铁水平,而干扰Tfeb可增加细胞内游离铁水平（1）与Lv-GFP组相比,Lv-TFEB组细胞中游离Fe2+的荧光强度明显降低（P＜0.001）,提示高表达TFEB可降低细胞内游离的Fe2+水平。（2）与si NT组相比,游离Fe2+的荧光强度明显增加（P＜0.05）,提示干扰Tfeb可增加游离Fe2+水平。钙黄绿素AM与Fe SO4灌流实验结果显示,与si NT组相比,si Tfeb组细胞的荧光强度明显降低（P＜0.05）,提示干扰Tfeb可增加细胞摄取铁的速率,进一步提示干扰Tfeb可增加细胞内游离铁。3.高表达TFEB可增加溶酶体上Tf R1蛋白表达与Lv-GFP组相比,Lv-TFEB组溶酶体上的Tf R1蛋白表达显著增加（P＜0.05）,Lv-TFEB组细胞中Lamp1与Tf R1的共定位相关性增加（P＜0.05）,提示高表达TFEB可增加溶酶体上的Tf R1蛋白表达。4.TFEB以Tf R1依赖的方式调节FTL与FTH的表达（1）与si NT组相比,si Tf R1组细胞中Tf R1、FTL与FTH蛋白表达水平均降低,提示高表达TFEB以Tf R1依赖的方式调节FTL与FTH的表达。（2）与si NT组相比,si Tf R1组细胞中游离Fe2+的荧光强度明显增加（P＜0.05）,提示干扰Tf R1可增加细胞内游离Fe2+水平,进一步提示干扰Tf R1后,高表达TFEB降低胞浆内游离Fe2+水平的作用被抑制。5.铁超载时,高表达TFEB可降低细胞内游离Fe2+水平（1）与Lv-GFP+FAC组相比,Lv-TFEB+FAC组细胞中游离Fe2+的荧光强度明显降低（P＜0.001）,提示铁超载时,高表达TFEB可降低细胞内游离Fe2+水平。（2）在Lv-GFP-PC12细胞,FAC（100μM）处理24 h后（Lv-GFP+FAC组）,细胞内FPN蛋白表达明显增加（P＜0.05）;而在Lv-TFEB-PC12细胞,FAC（100μM）处理后（Lv-TFEB+FAC组）,FPN蛋白表达无明显变化。提示铁超载可增加PC12细胞铁转出蛋白FPN表达,但是高表达TFEB后,可能是因为胞浆内游离铁水平未升高,FPN表达无明显变化。（3）与Lv-GFP+FAC组相比,Lv-TFEB+FAC组细胞中FTL与FTH蛋白表达无明显变化,提示铁超载时,高表达TFEB对FTL与FTH蛋白表达无明显影响。推测这可能是因为铁超载对铁蛋白的上调作用达到饱和。6.高表达TFEB可降低细胞对Erastin诱发铁死亡的敏感性（1）与Lv-GFP+Erastin组相比,Lv-TFEB+Erastin组的细胞数目增加（P＜0.05）,提示高表达TFEB可降低细胞对Erastin诱发铁死亡的敏感性,减少细胞死亡发生。（2）与Lv-GFP+Erastin组相比,Lv-TFEB+Erastin组细胞中FTL与FTH蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）,FPN蛋白的表达水平降低（P＜0.05）,提示高表达TFEB可能通过增加FTL、FTH的表达,发挥对抗铁死亡、保护细胞的作用。结论:综上所述,高表达TFEB可通过上调铁蛋白（FTL和FTH）、溶酶体Tf R1的表达,降低细胞内游离铁水平,从而参与铁代谢;高表达TFEB以Tf R1依赖的方式调节FTL与FTH的表达;铁超载时,高表达TFEB可能是通过增加溶酶体铁储存,而降低细胞内游离铁水平;高表达TFEB可能通过增加FTL与FTH的表达,降低细胞对Erastin诱发铁死亡的敏感性,具有对抗铁死亡、保护多巴胺能神经元的潜在作用。本课题的开展将丰富自噬参与铁代谢（尤其是溶酶体铁代谢）的理论基础,为防治PD提供新的研究思路。