胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。目前胃癌的治疗手段主要有手术切除和化疗，但均不能有效解决肿瘤转移、复发等问题。近年来，肿瘤疫苗的研究给胃癌的防治带来了希望。但是因为缺乏高效、特异的胃癌特异性抗原或胃癌相关抗原，使胃癌疫苗的研制发展缓慢。本研究所在八十年代发现了特异性较高的胃癌MG7抗原，并证实其与胃癌发生发展的进程有极好的相关性，抗原分析表明其抗原决定簇位于糖链上。由于糖抗原免疫原性弱，且纯化、制备困难，已有学者用分子模拟多肽替代糖抗原进行免疫治疗，并在动物模型中取得很好的效果。本研究所用噬菌体随机肽库技术筛选得到了MG7抗原的模拟肽表位，初步证实可以有效地模拟天然抗原，这为胃癌疫苗的研究奠定了基础。 抗原模拟表位多为8-12多肽，在体内容易被降解，故难以激发有效的免疫反应，因此需选择适当的载体或佐剂保护抗原表位，并促进其递呈给T淋巴细胞，诱导特异性的免疫反应。热休克蛋白70(HSP70)是一种伴侣分子，可以与蛋白及多肽结合，防止其降解并促进复性，而且HSP70还具有免疫佐剂的效应，能够辅助外源性抗原进入MHCI类和MHCII类途径，诱导高效特异的细胞、体液免疫反 第四军医大学硕士学位论文 一 应。此外，有学者证实HSP70本身就是一种非洲C的抗原提呈分子， 可以在细胞表面直接将抗原肽递呈至T细胞。HSP70在各种生物体中 高度保守，不易引起异体间的免疫反应，不会干扰抗原特异性免疫 的结果。因此，HSP70被认为是一种良好的免疫佐剂，可用于肿瘤 疫苗的研究。以HSP70为基础的疫苗己进入临床试验阶段。HSP70 既可以与抗原肽进行体外重组，形成HSP70－肽复合物，也可以利用 基因工程技术制备HSP70肽的融合基因或蛋白，诱导抗原特异性的 免疫反应，并进行免疫治疗。 DNA疫苗由于其高效、持久的免疫效应及制备简便的特点己广泛 用于肿瘤疫苗的基础研究。DNA疫苗兔疫途径有肌肉注射、皮下注射、 基因枪皮下轰击、静脉注射和荡膜接种等，其中肌肉免疫最常用。 近两年来，有学者采用流体动力介导的静脉注射法进行基因转运， 这种方法通过注射大量的溶液造成瞬时静脉高压，使质粒快速进入 组织细胞到达细胞核，进行高效表达。该方法为基因功能及免疫治 疗的研究提供了新的手段。 目的 以HSP70为载体，构建MG7－Ag模拟表位与HSP70的融合 基因疫苗，井观察该疫苗能否诱导BALB八小鼠产生特异性体液免疫、 细胞免疫及体内抗瘤效应。 方法1．根据HSP70全长基因序列设计针对其编码区的引物， 在下游引物的宁端加人MG7模拟表位的核昔酸序列。以pBBS／hsp70 质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物插入pUCm－T载体，进行酶切鉴 定及测序。2．利用基因重组技术，将测序正确的目的片段克隆入原 核表达载体 pET士 （入 转化大肠杆菌并进行原核表达。用 SDS －PAGE、Western blot及点印迹对表达产物进行鉴定。3．将融合基 因片段亚克隆入真核表达载体pCDNA3．l（＋）构建融合基因疫苗。 4 第四军医大学硕士学位论文 一 pcDNA3．l（＋）／GC－HSP70基因疫苗采用肌肉注射和流体动力介导的静 脉注射两种方式免疫接种BALB八小鼠，每隔3周加强免疫一次，共 免疫3次。以空载体及pCDNA3．l（＋）／HSP70质粒为对照。分别于初 次免疫后3、6、9周收集血清，进行ELISA及免疫组化染色。第9 周时取小鼠脾细胞，用‘℃r释放法进行体外杀伤实验，检测脾细胞 对靶细胞的杀伤活性。第9周时用表达有MG7hg的小鼠艾氏腹水瘤 对静脉接种的各组小鼠进行肿瘤攻击实验，25天后观察小鼠成瘤情 况。用间接免疫荧光法检测免疫血清中的抗核抗体，以反映血清中 抗DNA抗体的水平。 结果1．经PCR扩增出约2．okb的片段，与预期大小一致， 测序结果表明：MG7hg模拟表位的编码序列己成功融合于uSP70 CDNA的 3’末端；HSP70基因序列与文献报道一致。2．融合基因克隆 入原核表达载体pET－2 la（），进行原核表达。SDS－PAGE发现在Mr为 72m处有表达量明显增多的蛋白?