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许多动物实验和临床调查中都已证实,高血脂症与许多慢性代谢性疾病密切相关。动植物油脂中所含的必须脂肪酸对保持人体健康有着重要的生理作用。膳食多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids PUFA)具有影响血脂代谢的作用,其中具有功效的类型为n-3与n-6。然而,单一摄入某种植物油的脂肪酸构成模式均不合理。目前,联合国粮食农业组织(FAO)提出脂肪酸n-6/n-3营养素推荐量比值为5~10:1。在当今的饮食条件下,n-6PUFAs一般是过量的,而n-3PUFAs严重不足,然而学术界至今对二者合理的比值仍有争论。已有研究表明,PUFA发挥改善血脂作用至少部分是通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP– activated protein kinase AMPK)。AMPK的作用底物就包括羟甲基戊二酰单酰辅酶A(HMGR)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、激素敏感脂酶(HSL)、糖原合成酶等。AMPK是进食行为的主要调控因子。人们对下丘脑神经元AMPK对食欲的影响机制,仍不甚了解。但下丘脑AMPK调控食欲至少是通过调节神经肽Y(NPY)和AGRP等促食欲因子的表达而实现的。AMPK活性变化可通过细胞内丙二酰辅酶A的浓度和肉碱酯酰转移酶1(CPT-1)的活性影响食欲。本实验设计的PUFA比例一个使用推荐比值,另一个使用较高比例的n-3,以纠正饮食中n-6过高的状况。本实验通过给SD大鼠不同脂肪酸配比膳食,以得到合理n-3/n-6脂肪酸配比,并探索PUFA是否能够通过外周和中枢作用于AMPK通路调节全身营养代谢,为人们用PUFA的食物预防和治疗高血脂、心血管疾病提供科学依据。实验方法58只清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠适应性喂养1周后,尾静脉采血测得血清总胆固醇(TC)水平后随机分为6组,分别为:空白对照组9只,高脂对照组9只,高脂1:1组10只,高脂1:5组10只,低脂1:1组10只,低脂1:5组10只。实验期为45d。大鼠单笼喂养,饮去离子水,根据体重给予不同需要饲料,六组饲料分别为基础饲料;高脂饲料;n-3/n-6为1:1的高脂饲料(n-3为亚麻酸油,含60%α亚麻酸;n-6为琉璃苣油,含20%γ亚麻酸,40%亚油酸);n-3/n-6为1:5的高脂饲料;n-3/n-6为1:1的低脂饲料;n-3/n-6为1:5的低脂饲料。记录大鼠每日进食量和体重变化。分别于实验前一天,实验第15d,第30d尾静脉取血,分离血清,37℃水浴30min,4 000 r/min离心分离血清,用试剂盒检测TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。实验第45d时,禁食12h,乙醚麻醉后处死大鼠,迅速取肝脏及下丘脑组织,生理盐水冲洗,滤纸拭干,冻存于液氮中备测mRNA及蛋白质表达。取皮下脂肪、腹膜下脂肪、睾周脂肪、肾周脂肪分别称重,计算脂体比。实时RT-PCR定量分别检测肝中PPAR-γ、AMPK-α2 mRNA及下丘脑中NPY、AMPK-α2 mRNA表达水平。Western blot分别检测肝中及下丘脑中AMPKα及磷酸化AMPKα蛋白浓度。实验结果1.不同n-3/n-6配比脂肪酸对大鼠血脂水平的影响实验第45d,高脂组TC、TG、LDL-C水平均高于其他五组,差异均有统计学意义(P <0.05);45天时空白组和高脂1:1组比高脂组HDL-C有显著差异(P<0.05)。可见PUFA对大鼠血脂水平有显著改善。2.不同n-3/n-6配比脂肪酸对大鼠体重及脂体比的影响实验45d后,各组动物体重都有所增加。高脂组与其他五组体重相比,差异均有统计学意义(P <0.05)。高脂1:5和低脂1:5组皮下脂肪与高脂组相比,差异均有统计学意义(P <0.05)。添加PUFA的4组腹膜下脂肪、睾周脂肪、肾周脂肪比率及脂体比与高脂组比较,差异均有统计学意义(P <0.05)。说明PUFA能够降低大鼠体重和体脂,尤其是对降低内脏脂肪积累的作用明显。3.不同n-3/n-6配比脂肪酸对大鼠摄食量的影响:实验第12天开始,PUFA四个比例组大鼠食欲明显减少,与高脂组和空白组相比差异具有统计学意义,(P<0.05)且作用时间比较持久。表明PUFA能降低大鼠食欲。4.不同n-3/n-6配比脂肪酸对大鼠AMPK-α2和PPAR-γ及NPY mRNA表达的影响:给予不同配比脂肪酸膳食45天,添加PUFA的四个比例组肝AMPK-α2及PPAR-γmRNA表达水平均与空白对照组相比有所下降,但和高脂组相比表达有显著升高,且差异具有统计学意义(P<0.05),说明PUFA能增强肝AMPK和PPAR-γmRNA的表达。但是四个比例组下丘脑AMPK-α2及NPYmRNA表达与高脂组和空白组相比均显著降低,且差异具有统计学意义(P<0.05),高脂1:5组与低脂1:1组有显著差别(P<0.05),说明PUFA能抑制下丘脑中AMPK及NPYmRNA的表达。5.不同n-3/n-6配比脂肪酸对大鼠AMPK-α及磷酸化AMPK蛋白的表达的影响:给予不同配比脂肪酸膳食45d,四个比例组(高脂1:1、高脂1:5、低脂1:1、低脂1:5)肝AMPK-α亚基总蛋白表达水平均与空白组相比明显增加,高脂组AMPK活性明显降低,高脂两个比例组该活性低于空白组和低脂两个比例组,且低脂1:1组AMPK-α活性最强,说明PUFA能增强肝AMPK蛋白活性表达。然而在下丘脑,四个PUFA比例组下丘脑AMPK-α亚基总蛋白表达水平均比空白组显著降低;高脂组与空白组相比该表达无显著差异。四个PUFA比例组下丘脑AMPK-α磷酸化活性均明显低于空白组及高脂组。低脂1:1组和低脂1:5组AMPK-α磷酸化表达水平明显低于高脂1:1组和高脂1:5组,高脂组AMPK活性与空白组相比该表达无显著差异。说明PUFA能抑制下丘脑AMPK蛋白活性表达。实验结论n-3/n-6 1:1与1:5两个比例的PUFA膳食均改善大鼠高血脂并降低脂肪积累,可能是通过增加肝中AMPK表达及PPAR-γ等脂肪酸氧化基因表达,并抑制下丘脑食欲相关基因NPY及AMPK表达有关。但是由于脂肪代谢的变化是多种因素共同作用的结果,因此要阐明PUFA影响肥胖大鼠脂肪代谢的机制,还需要进一步的深入研究。