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目的1.确定上颌窦黏膜细胞(maxillary sinus membrane cells,MSMCs)的干细胞特性。2.建立雷帕霉素(rapamycin,RAPA)诱导MSMCs自噬(autophagy)的细胞模型。3.探索自噬对MSMCs成骨分化的影响。方法1.全骨髓贴壁法分离培养骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),改良酶消化法分离培养MSMCs;流式细胞术(flow cytometry,FCM)鉴定P3细胞表型;结晶紫染色并计数集落形成比较BMSCs和MSMCs的克隆形成率;WST-8法检测细胞生长曲线,比较BMSCs和MSMCs的细胞群体倍增时间;茜素红染色(alizarin red staining,ARS)比较BMSCs和MSMCs成骨分化能力;油红O染色比较BMSCs和MSMCs成脂分化能力;阿尔新蓝染色比较BMSCs和MSMCs成软骨分化能力。2.不同浓度RAPA诱导MSMCs,建立细胞自噬模型;透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)检测MSMCs自噬溶酶体的形成;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色定性检测MSMCs自噬水平;FCM定量检测MSMCs自噬诱导率。3.5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/tetranitroblue tetrazolium chloride,BCIP/NBT)染色定性检测MSMCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达水平;对硝基苯磷酸二钠(disodium4-nitrophenyl phosphate,p NPP)法定量检测MSMCs ALP表达量;ARS检测MSMCs钙沉积物水平;免疫印迹实验(western blot,WB)检测MSMCs成骨相关蛋白与自噬相关蛋白改变的一致性;免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测MSMCs内成骨相关蛋白随自噬相关蛋白改变产生的定位变化;反转录-实时定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative real time polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测MSMCs成骨相关基因表达和自噬相关基因表达(autophagy-related genes,ATGs)。4.建立不同自噬水平MSMCs的异位成骨模型;苏木精-伊红染色(hemotoxylin and eosin,HE)、Masson染色、Goldner染色定性检测MSMCs体内异位成骨水平。结果1.成功分离培养BMSCs和MSMCs;MSMCs阳性表达CD90和CD146,阴性表达CD34、CD45、CD105和CD166,BMSCs阳性表达CD90、CD105、CD166和CD146,阴性表达CD34和CD45;MSMCs克隆形成率稍弱于BMSCs(p<0.05);MSMCs对数生长期为接种后4~7 d,且具有不弱于BMSCs的细胞群体倍增时间(p<0.05);MSMCs成骨分化能力稍强于BMSCs,MSMCs成脂分化能力逊于BMSCs,MSMCs成软骨分化能力逊于BMSCs。2.在成骨诱导后7 d,在0~1000 n M的RAPA浓度诱导范围内,梯度增加的RAPA浓度可成功诱导MSMCs产生梯度增加的自噬溶酶体,并产生梯度增加的自噬诱导率。3.在成骨诱导后7 d,在0~1000 n M的RAPA浓度诱导范围内,MSMCs的成骨相关蛋白和基因(OCN、RUNX2、OPN、COL1)的表达量先升高后降低,并在100 n M时达到顶峰;在成骨诱导后14 d,在0~1000 n M的RAPA浓度诱导范围内,MSMCs的成骨相关蛋白和基因(OCN、RUNX2、OPN、COL1)的表达量差异减小;在成骨诱导后21 d,在0~1000 n M的RAPA浓度诱导范围内,MSMCs的成骨相关蛋白和基因(OCN、RUNX2、OPN、COL1)的表达量趋于一致,BSP表达量先升高后降低,并在100 n M时达到顶峰;蛋白定位随自噬水平改变而改变。结论1.从SD大鼠上颌窦中分离培养得到的MSMCs具有干细胞的高增殖和多向分化等特征。MSMCs的成骨潜力稍高于BMSCs。2.RAPA可有效诱导MSMCs的自噬,在0~1000 n M的范围内,MSMCs的自噬水平随着RAPA的浓度升高而升高。3.在成骨诱导后7 d,在0~1000 n M的RAPA浓度诱导范围内,MSMCs的成骨分化水平随着自噬水平的变化,先升高后降低。随着时间推移,在成骨诱导后14 d和21 d,不同浓度RAPA处理组自噬水平和成骨分化水平趋于一致。这说明自噬在MSMCs成骨分化过程中起重要作用。