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菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)是双生病毒科(Geminiviridae)最大的属,包含400多个病毒种。近几十年来,begomoviruses在全球各地暴发,给农业生产造成严重威胁。研究begomovirus的基因功能,有助于认识begomovirus侵染机理,进而为begomovirus相关病害的防控提供理论支撑。新竹番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Hsinchu virus,ToLCHsV)是一种广泛分布于我国台湾、海南、广东、福建、浙江和江苏等地的begomovirus。本研究对ToLCHsV的AC2和AC4进行了功能解析,主要实验和结果如下:(1)AC2和AC4在ToLCHsV侵染中的作用:通过定点突变构建了三个ToLCHsV突变体:ToLCHsV-ΔAC2(不能表达AC2)、ToLCHsV-ΔAC4(不能表达AC4)和ToLCHsV-ΔAC2-AC4(不能表达AC2和AC4),并通过本氏烟接种实验研究了这三个突变体的侵染性。发现三个ToLCHsV突变体都能系统侵染本氏烟,并造成严重症状。但在症状产生的时间上,ToLCHsV-ΔAC2比野生型ToLCHsV慢1-2天,而ToLCHsV-ΔAC4和ToLCHsV-ΔAC2-AC4比野生型ToLCHsV慢2-3天。在病毒DNA积累的动态上,三个ToLCHsV突变体表现出一定差异:在第9天,它们在本氏烟中的积累水平从高到低依次为ToLCHsV-ΔAC4、ToLCHsV-ΔAC2-AC4和ToLCHsV-ΔAC2,在第18天依次为ToLCHsV-ΔAC2-AC4、ToLCHsV-ΔAC4和ToLCHsV-ΔAC2;在第27天,ToLCHsV-ΔAC2-AC4的积累水平最低,而ToLCHsV-ΔAC2和ToLCHsV-ΔAC4没有明显差别。然而,在所有三个时间点,三个ToLCHsV突变体的积累水平都比野生型ToLCHsV低。(2)AC2与AC4抑制转录后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)和转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS)的活性:为判定ToLCHsV的AC2和AC4是否具有PTGS抑制子活性,本研究将这两个蛋白的ORF分别构建到了瞬时表达载体pEarlyGate100,获得pEarlyGate100-AC2与pEarlyGate100-AC4。将pEarlyGate100-AC2与pEarlyGate100-AC4以农杆菌注射的方式分别与一个表达GFP mRNA的二元载体(35S-GFP)共同导入16c本氏烟叶片后观察GFP荧光情况,并检测GFP mRNA积累水平。结果表明AC4能显著抑制PTGS的发生,而AC2没有这种功能。(3)AC2与AC4的亚细胞定位和它们增强异源病毒侵染的能力:为明确ToLCHsV AC2与AC4的的亚细胞定位,本研究将AC2/AC4的ORF分别构建到pEarlyGate101载体,获得能表达AC2/AC4-YFP融合蛋白的二元载体pEarlyGate101-AC2/AC4。将pEarlyGate101-AC2和pEarlyGate101-AC4以农杆菌注射的方式分别导入本氏烟叶表皮细胞,并在导入后的第二天利用共聚焦显微镜观察YFP荧光在细胞中的分布。结果表明,AC2-YFP在细胞质和细胞核中都有分布,而AC4-YFP主要定位于细胞质的叶绿体中。为研究ToLCHsV AC2与AC4是否能增强异源病毒的侵染,本研究以PVXAC2和PVX-AC4分别接种本氏烟。结果表明,ToLCHsV AC2与AC4都能显著增强PVX的致病性,并能大幅提升PVX在本氏烟中的积累水平。在增强PVX致病性和积累水平上,AC2比AC4活性更强。综上,本研究加深了我们对ToLCHsV AC2与AC4基因功能的认识,为解析ToLCHsV的侵染机理奠定了基础。另外,本研究发现AC2对ToLCHsV的侵染不是必须的,且ToLCHsV的AC4定位于叶绿体,这两点与之前报道的其它begomoviruses的情况明显不同。因此,本研究也为全面认识begomoviruses AC2与AC4的基因功能提供了新的视角。