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许多细胞因子和生长因子通过JAK/STAT途径传导信号,其中JAN2与造血关系最为密切,STAT5(信号转导子与转录激活子)是JAK2最主要的下游信号蛋白。STAT5被JAK2磷酸化后形成二聚体,进入核内,调节相关基因的转录,维持细胞的生长分化与增殖。急性髓系白血病常与染色体异常以及致癌蛋白的形成密切相关,它们激活恶性细胞存活与增殖的信号转导途径。在这些信号转导途径中,某些基因的过渡表达或突变引起的JAK2-STAT5信号途径的持续激活对髓系原始细胞的恶性转化犹为重要,因此药物阻断JAK2-STAT5信号途径进而抑制AML细胞的恶性增殖已经成为AML靶向治疗的重要组成部分。高三尖杉酯碱是一种具有抗白血病活性的植物碱,自二十世纪七十年代以来,在中国已经广泛应用于急慢性白血病和骨髓异常增生综合症的治疗,并取得显著疗效。尽管几个细胞学事件已经确定与其抗白血病效应相关,包括:抑制蛋白合成和端粒酶活性,下调Mcl-1,Survivin,内皮生长因子等与细胞的恶性密切相关的因子的表达,上调前凋亡蛋白Bax的表达和Caspase-3介导的PARP的剪切等等,但HHT对JAK2-STAT5信号转导通路的影响的相关研究尚未见报道。我们的研究中,分离AML病人骨髓单个核细胞,与0,20,40,80ng/ml的HHT共同培养48小时后采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltelra-zolium bromide)比色法观察HHT对AML原代细胞的生长抑制作用,结果发现:HHT对AML病人原代细胞具有显著生长抑制作用,呈浓度依赖性(20,40,80ng/ml的HHT的抑制率分别为16.49±2.70%,24.81±5.49%,47.58±4.31%),对健康者骨髓抑制作用不明显(抑制率分别为5.56±1.37%,7.41±2.13%,12.04±3.21%)。进一步研究HHT对AML细胞株HEL,K562,HL-60的生长抑制作用:HHT对HEL作用48小时的半数抑制浓度(IC50)为64.74ng/ml,对K562细胞的半数抑制浓度为116.5ng/ml,HL-60为77.3ng/ml.我们同时也观察了HHT对HEL细胞的诱导凋亡作用:0,10,20,40,80,160ng/mlHHT处理HEL48小时后,40ng/ml的HHT作用即开始产生DNA ladder,随着HHT浓度的增加,产生的条带越多.流式细胞仪检测发现:0,10,20,40,80ng/mlHHT作用HEL细胞24h后PI及AnnexinV染色,HHT诱导HEL细胞凋亡呈浓度依赖方式,10,20,40,80ng/ml组细胞凋亡率分别为5.14±0.28%、10.58±0.22%、24.4±2.01%及39.61±2.66%,均明显高于对照组(1.51%).早期的研究发现,慢性粒细胞白血病细胞Bcr-Abl融合蛋白能激活JAK2-STAT5信号途径,甚至MAPK,PI3K等生长途径。JAK2V617F突变在MPD病人中能引起多种信号途径的组成性激活(JAK-STAT,MAPK,PI3K)等,其中主要是STAT5,被JAK2磷酸化激活后能激活多种基因的转录,包括Bcl-xl,一种过渡表达于PV患者红系祖细胞的抗凋亡蛋白,在细胞增殖和存活方面起重要作用。我们假设HHT主要在蛋白水平影响JAK2-STAT5信号转导途径。Western blot检测了HHT对JAK2-STAT5信号途径中蛋白表达的影响。结果显示:不同浓度的HHT作用AML原代细胞,HEL,K562 6小时后,JAK2,STAT5总蛋白水平无显著改变,但其磷酸化水平明显下调,且呈浓度依赖性(K562细胞中,JAK2表达也下调)。而RT-PCR结果提示JAK2,STAT5在mRNA水平都无改变。进一步的研究显示:6小时后,HEL中Bcl-xL的表达无变化,而将时间延长致24小时后,Bcl-xL表达下调,在mRNA水平也呈浓度依赖性下调。试验结果初步提示:HHT是通过抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)的活性阻断JAK2-STAT5信号通路的磷酸化,进而抑制与细胞恶性增长相关的通路达到抑制增长和诱导凋亡的。由于AML原代细胞及细胞株中也都有MAPK和PI3K途径的激活,我们也同时观察了HHT作用于HEL,K562细胞株后这两个信号通路在蛋白水平的变化。结果发现:不同浓度的HHT作用HEL,K562细胞后,在AKT,ERK1/2总水平恒定的情况下,AKT的磷酸化水平呈剂量依赖性下调,可能与JAK2是通过BCR-ABL/JAK2/Gab2/PI3K/AKT网络调节AKT活性相关,当JAK2活性受到抑制时,AKT的磷酸化水平也下调。但ERK1/2的磷酸化水平则无显著变化,具体机制尚不清楚,或许其他的锚定蛋白如Grb2,Gab2等也参与ERK1/2活性的调节有关。为了进一步证实HHT是通过抑制JAK2-STAT5通路的信号蛋白酪氨酸磷酸化实现其效应的,我们观察JAK2特异性抑制剂AG490单独以及与HHT协同作用HEL,K562细胞的效应。结果发现:AG490单独以及与HHT共同作用这两种细胞后,均能诱导凋亡,WB检测也发现,HEL中,JAK2,STAT5磷酸化水平下调,而K562细胞株中,JAK2磷酸化水平下调,但STAT5的磷酸化无显著变化,可能与K562细胞株中JAK2和STAT5是由Bcr/Abl分别激活有关。也进一步提示HHT不仅只作用于JAK2,而是作为一种广谱的PTK抑制剂在阻断JAK2-STAT相关信号通路中发挥作用。综上所述,我们的研究结果表明:(1)HHT对急性髓系白血病原代细胞以及细胞株HEL,K562和HL-60细胞有显著的生长抑制作用。这种生长抑制作用呈剂量依赖性。(2)10ng/mlHHT即可诱导HEL的早期凋亡,10,20,40,80ng/ml组细胞凋亡率分别为5.14±0.28%、10.58±0.22%、24.4±2.01%及39.61±2.66%,均明显高于对照组(1.51%).但DNA ladder发现在40ng/ml时开始出现凋亡条带,且HHT浓度越大,凋亡条带越多。(3)不同浓度的HHT作用AML原代细胞,HEL,K562 6小时后,JAK2,STAT5总蛋白水平无显著改变,但其磷酸化水平明显下调,且呈浓度依赖性(K562细胞中,JAK2表达也下调)。而RT-PCR结果提示JAK2,STAT5在mRNA水平都无改变。进一步的研究显示:6小时后,HEL中Bcl-xL的表达无变化,而将时间延长致24小时后,Bcl-xL表达下调,在mRNA水平也呈浓度依赖性下调。此外,经不同浓度HHT作用6小时后HEL与K562细胞中AKT的磷酸化水平都下调,但ERK1/2磷酸化无显著变化。(4)JAK2特异性抑制剂AG490单独以及与HHT共同作用这两种细胞后,均能诱导凋亡,WB检测也发现,HEL中,JAK2,STAT5磷酸化水平下调,而K562细胞株中,JAK2磷酸化水平下调,但STAT5的磷酸化无显著变化。