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酶-前药疗法是一种针对癌症的非常有前景的疗法,包含了靶向肿瘤部位的酶以及相对低毒性的前药两部分。酶-前药疗法具有独特的优势,酶-前药组合中的辣根过氧化物氧化酶通常被用来催化前药吲哚三乙酸转变为细胞毒性产物3-亚甲基-2-羟吲哚。由于酶-前药疗法存在酶在体内稳定性较差、非哺乳动物来源的酶具有免疫原性等缺陷,限制了该疗法的应用。因此开发确定酶-前药反应的发生以及酶-前药疗法中酶的活性的检测方法是至关重要的。据文献报道,酶-前药组合HRP-IAA反应过程存在质子浓度的变化,因此我们推测可以利用荧光蛋白通过检测pH值的变化来实时监测这一催化反应过程。本课题首先表达和纯化了pH敏感的绿色荧光蛋白突变体ratiometric pHluorins,并对其性质进行了一系列的研究。实验结果显示该蛋白存在双激发峰397 nln和483 nm,一个发射峰507 nm,其在不同激发波长下的发射荧光强度比值R397/483随着pH值的增加而增大。其次,利用精密pH计检测HRP-IAA反应,确认这一反应过程存在pH的变化；通过比率荧光蛋白pHluorins检测到随着反应的进行,其R397/483的数值从1.32变化至1.21,根据计算得出HRP的酶活为3.6 U/mL。将pHluorins与HRP通过化学方法交联后,研究表明交联产物的R397/483仍然随着pH值的增加而增大；加入前药IAA后,结果显示R397/483从1.47变化至1.40,计算得出HRP的酶活为0.6 U/mL。最后将纯化的蛋白pHluorins以及pHluorins与HRP交联产物在人乳腺癌细胞Bcap-37存在下检测]3RP-IAA反应,发现交联产物随着反应的进行其R397/483从1.50变化至1.42,这一结果说明pHluorins-HRP交联产物能够在细胞存在条件下监测HRP-IAA反应的进行。