论文部分内容阅读
目的:随着糖尿病(diabetes mellitus，DM)发病率的逐年上升，DM引起的肝脏病变的严重性也日益受到关注。糖尿病肝脏病变早期主要表现为非酒精性脂肪肝，进一步可发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化;肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSCs)的活化是肝纤维化的中心环节，HSCs激活后，其表型向肌成纤维细胞转化，产生大量细胞外基质，胶原作为细胞外基质的主要成分，其中又以Ⅰ型、Ⅲ型为主。目前糖尿病所致肝纤维化的具体机制尚不明确。本研究通过体外高糖培养HSCs，观察RhoA/ROCK和MAPKs信号通路对HSCs胶原合成的影响，探讨糖尿病肝纤维化发生的可能机制，为糖尿肝脏病变的防治提供新的依据。 方法:通过体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)，台盼蓝染色法进行HSCs活力鉴定。选用2-5代HSCs，无血清1640培养基同步化2小时，将其随机分为6组:正常对照组（NG:含5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖组(HG:含25 mmol/L葡萄糖)、高渗透压组（OSM:5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）、HG+法舒地尔组(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)，培养24小时后，测定培养基中羟脯氨酸(HYP)含量，估算胶原含量。采用实时荧光定量PCR测定Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA表达。采用Western blot法测定HSCs磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(p-MYPT1)水平，代表ROCK活性;细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平反应MAPKs信号通路的激活状态。 结果: 1、高糖和法舒地尔对培养基中HYP含量的影响:与对照组相比，高糖组HYP含量显著升高(17.55±0.80μg/ml vs.26.24±0.91μg/ml，P＜0.01);与高糖组比较，高糖中加入法舒地尔(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)后，HYP含量呈浓度依赖性的显著减少(23.22±0.62μg/ml、21.58±1.16μg/ml、19.31±0.37μg/ml vs.26.24±0.91μg/ml,P＜0.01)。高渗透压组HYP含量与对照组相比无显著差异（17.24±0.67μg/ml vs.17.55±0.80μg/ml,P＞0.05）。 2、高糖和法舒地尔对Ⅰ型、Ⅲ型前胶原基因表达结果:高糖组Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA表达较对照组显著上调(P＜0.01);与高糖组比较，高糖中加入法舒地尔后(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)，Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA表达显著减少(P＜0.01);高渗透压组Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRNA表达与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。结果提示:高糖促进了HSCs胶原合成，法舒地尔能够抑制高糖诱导的胶原合成，高渗透压对胶原的合成没有影响。 3、高糖和法舒地尔对ROCK活性的影响:磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1（p-MYPT1），是ROCK信号通路激活的标志，反应了ROCK的活性。与对照组比较，高糖组p-MYPT1水平显著升高(P＜0.01);与高糖组比较，在高糖中加入法舒地尔(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)后p-MYPT1水平显著降低（P＜0.01）;高渗透压组p-MYPT1水平较对照组无显著性差异(P＞0.05)。结果提示:高糖能够激活ROCK，高渗透压对ROCK没有影响，法舒地尔可以阻断高糖诱导的ROCK的过度激活。 4、高糖和法舒地尔对MAPKs通路的影响:MAPKs成员主要包括ERK1/2、JNK和p38MAPK，其磷酸化水平代表了各自的活性。与对照组相比，高糖组ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平显著升高(P＜0.01);与高糖组比较，在高糖中加入法舒地尔(12.5 umol/L、25 umol/L、50umol/L)后，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平显著地降低(P＜0.01);高渗透压组ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平较对照组无显著差异(P＞0.05)。结果提示:高糖能够激活MAPKs通路，MAPKs是ROCK的下游信号分子，高渗透压对MAPKs信号通路没有影响。 结论: 1、高糖能够诱导大鼠肝星状细胞胶原合成; 2、RhoA/ROCK通路可能通过其下游的MAPKs通路介导了高糖诱导的胶原合成。