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兽药在现代养殖业中发挥着十分重要的作用,但近年来,一些养殖人员或企业为了节约成本、获得较高抗菌效果而不顾国家规定滥用抗菌药物甚至使用禁用兽药,造成了动物源性食品中兽药的残留,严重威胁人类健康和自然环境。虽然硝基吱喃类药物属于广谱抗菌药,对大多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑菌、杀菌作用,但研究发现该类药物均具有致癌、致突变、致畸毒性,因此各国已将其列为禁用兽药。呋喃唑酮是硝基呋喃类药物中常用的一种,其代谢物3-氨基-2-噁唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)具有强烈的致癌、致突变作用,目前国内外用于检测呋喃唑酮残留的方法多为仪器分析法和免疫分析法。为了提高灵敏度、减少基质干扰、缩短样品前处理时间,本试验主要通过制备AOZ单克隆抗体,与纳米磁珠、琼脂糖凝胶偶联,制成AOZ免疫磁珠、AOZ免疫亲和层析柱,并优化各自吸附、洗脱条件,最终应用于鸡肉样品前处理中富集净化AOZ的衍生物3-[[(4-硝基苯基)-亚甲基]-氨基]-2-噁唑烷酮(NPAOZ),经间接竞争ELISA测定最低检测限和回收率以确定免疫磁珠和免疫亲和层析柱的使用性能。试验Ⅰ AOZ单克隆抗体的制备及鉴定采用活化酯法将CPAOZ与BSA偶联制成免疫原免疫小鼠,第四次免疫后取最佳免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,并进行亚克隆与冻存。于小鼠腹腔接种细胞后,收集的腹水即为AOZ单克隆抗体,对其进行特性分析得出:该AOZ单抗的效价为1:100万,对NPAOZ的半数抑制浓度为0.31 ng/mL;利用间接竞争ELISA法对四种硝基呋喃类药物代谢物的衍生物(NPAOZ、NPAMOZ、NPAHD、NPSEM)以及对硝基苯甲醛、对醛基苯甲酸进行交叉抑制试验发现,AOZ单抗只与NPAOZ有反应,而与其它药物均无交叉反应。表明本试验制得的AOZ单克隆抗体具有高效价、高灵敏度、高特异性的特点。试验Ⅱ AOZ 免疫磁珠的研制先将纳米磁珠经EDC和NHS活化,并与AOZ单克隆抗体偶联制成AOZ免疫磁珠,对该磁珠的上样、洗脱条件进行优化,最终应用于鸡肉样品前处理中,并利用间接竞争ELISA法进行加标回收试验。结果表明,1 mg纳米磁珠活化后可与50 μgAOZ单克隆抗体偶联;在样品液pH值为7条件下,上样吸附10 min,磁珠对NPAOZ可保持较高吸附率;用300μL纯甲醇洗脱磁珠5 min,可将NPAOZ顺利洗下;AOZ免疫磁珠只对NPAOZ具有较高的特异性吸附,而对NPAHD、NPSEM、NPAMOZ均无吸附作用,该免疫磁珠重复使用两次后对NPAOZ的吸附率仍有86.5%。加标回收试验结果表明,加标量为0.25～2 ng/g时回收率均在78%以上,变异系数为5.3%～10.9%,最低检测限为0.049 μg/kg远低于常规样品前处理法的最低检测限0.139 μg/kg,说明基于免疫磁珠的样品前处理方法能有效富集鸡肉中NPAOZ,并有效提高了 ELISA检测方法的灵敏度。试验Ⅲ AOZ免疫亲和层析柱的研制将AOZ单克隆抗体偶联至CNBr活化的SepharoseTM4B胶上制成AOZ免疫亲和层析柱,优化层析柱的上样、洗脱条件,确定其柱容量和重复使用次数,最终应用于鸡肉样品前处理过程中富集NPAOZ,通过间接竞争ELISA方法测定AOZ回收率以及该方法的灵敏度。试验结果表明,当上样液pH为7.0,并以2 mL/min流速上样时,NPAOZ的吸附率大于90%,而用6 mL 90%甲醇水溶液以3 mL/min速度洗脱层析柱时,可将NPAOZ顺利洗脱下来,其洗脱率大于90%。该层析柱的柱容量为1.6 μg/mL,且至少可重复使用5次。加标试验结果表明,当加标量为1～8 ng/g时,AOZ回收率均大于80%,且变异系数小于10%,最低检测限为0.055 μg/kg。