天然橡胶(顺式-1,4-聚异戊二烯)是巴西橡胶树的一种次生代谢物,它与煤炭、石油、铁矿石并列为四大工业原料,也是一种关系国计民生的经济和战略物资。巴西橡胶树作为生产天然橡胶的主要来源,是一种非常重要的热带经济及能源作物。目前橡胶树主要通过嫁接进行繁殖。通过花药培养诱导出橡胶树花药体细胞植株经过脱分化和再分化过程发育而来具有幼态性状,同时具有自己的根系,被称为自根幼态无性系。橡胶树自根幼态无性系是一种新型的种植材料,具有生长速度快、产胶量高、抗逆性强的特点。对橡胶树幼态自根无性系高产的研究目前仅限于形态学观察和生理参数等而缺乏直接的分子生物学证据,在一定程度上限制了其在生产中的应用,也是目前国内外一些学者对其的潜力和实际利用价值持怀疑态度的主要原因。因此开展橡胶树幼态无性系高产的分子基础研究将对我们进一步了解橡胶树幼态无性系增产的原因具有重要的理论意义；同时对推动橡胶树幼态无性系种植材料的推广和应用,提高天然橡胶的产量也将具有重要的实践意义。应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对橡胶树自根幼态无性系的体胚发育过程基因组DNA中胞嘧啶甲基化模式和程度进行探讨。研究结果如下：1.对橡胶树体细胞胚发生过程的各种组织材料花药,愈伤组织,体细胞胚,再生植株幼芽,再生植株叶,移栽大田植株芽进行分析。35对引物在不同组织材料DNA中扩增出的清晰条带数最高的是花药外植体1549条,最低的是体细胞胚1522条。不同发育过程中的甲基化水平存在一定差异,花药中DNA甲基化程度最高(位点数352),体胞胚的甲基化水平最低(位点数是330)。2.不同的组织材料都得到三种类型甲基化特异条带,这些特异的甲基化条带分为17种不同的表达模式,而这些甲基化的片段可能组织的特异标记。3.不同的条带类型的改变在不同组织中也是经常见到,包括三种类型的条带的出现或消失,同时也有三种类型的相互转换。随着橡胶树体细胞胚发育过程的进行,在每次的转变阶段都会出现不同带型改变。4.对随机挑取的14个不同组织特异性条带进行测序。与公共数据库序列比对结果显示：14个序列中有6个有同源基因序列,而另外8个没有同源性。利用差减杂交(SSH)技术构建了自根幼态无性系与老态无性系胶乳差减cDNA文库,经Reverse Northern Dot-Blot进一步剔除假阳性片段后,随机挑取部分阳性克隆进行测序,进行Blastn和Blastx比较分析,结果表明在老态差减cDNA文库中获得33个差异表达cDNA片段,包括信号转导(8个)、转录相关(8个)、衰老相关蛋白(2个)、橡胶产排相关(2个)及物质代谢(8个)等相关基因；幼态差减cDNA文库中获得32个差异表达cDNA片段,包括信号转导(11个)、转录相关(6个)、衰老相关蛋白(2个)、橡胶产排相关(2个)及物质代谢(6个)等相关基因。选取编号(D5、T744、T227、D24、D267)5个阳性克隆进行RT-PCR分析,结果表明,(D5、D24、D4)在老态无性系胶乳表达量高,(T744、T227)在幼态无性系表达量高,与Reverse Northern Dot-Blot结果一致。对(D5、T744、D24、D267)4个克隆利用RACE方法获得全长eDNA序列,分别命名HbHDT1、HbSKP1、HbCC、Hb14-3-3a。HbHDT1序列全长为1197 bp,阅读框架长度为918 bp,预测编码的蛋白质有304个氨基酸。HbSKP1序列全长为788bp,阅读框架长度为543 bp,预测编码的蛋白质有179个氨基酸。HbCC序列全长为570bp,阅读框架长度为258 bp,预测编码的蛋白质有84个氨基酸。Hb14-3-3a序列长全为1154bp,阅读框架长度为795bp,预测编码的蛋白质有263氨基酸。对它们在不同组织(花、愈伤组织、培养12、21、40、53天的体细胞胚、叶、芽、胶乳)中的表达模式进行了研究,它们的表达情况各有不同,说明这些基因在胚胎发生过程中表现的生物学功能各不相同。茉莉酸和乙烯被认为参与天然橡胶生物合成的调控,运用RT-PCR方法研究茉莉酸和乙烯对它们表达的影响进行了研究,结果表明茉莉酸和乙烯对胶乳HbHDT1的表达基本无影响；茉莉酸明显的促进HbSKP1表达,而乙烯却抑制HbSKP1表达；茉莉酸促进HbCC基因的表达,而乙烯对胶乳HbCC的表达基本无影响；茉莉酸和乙烯对胶乳Hb14-3-3a的表达基本无影响,说明这些基因是通过不同途径来影响天然橡胶的合成。