背景：恶性肿瘤是当前一个全球性问题，是严重威胁人民健康和生命的多发病、常见病，世界各国均投入大量人力和物力进行肿瘤的研究。 用药物治疗肿瘤有悠久的历史，癌症的化学治疗作为一门较系统和独立的学科是从20世纪40年代初逐渐发展和建立起来的。随着生物学、生物化学和研究方法的改进，同时为了弥补传统肿瘤治疗的不足，越来越多的中外科学工作者把目光转向了一个颇具特色的领域——生物毒素的抗癌研究[1]。目前研究较多的是蛇毒、蝎毒以及蟾蜍毒等。人们试图从中分离出具有抗癌活性的组分，用于研制新的抗肿瘤药物以克服现有药物的毒副作用及肿瘤耐药性。 目前认为蝎毒是全蝎发挥药理作用的重要成分。由于蝎毒粗毒(ScorpionVwnomCrude，SVC)成分较为复杂，毒、副作用明显，并且不同种属或者同种属不同来源及不同的取毒条件等因素所造成的多种差异，不能直接用于基础及临床研究，故国内外的研究大都是把蝎毒分离纯化后进行的。纯化后的蝎毒抗癌多肽经实验对多种肿瘤具有明显抑瘤作用，且有良好的免疫调节功能，与放疗药和化疗合用可降低放疗和化疗的毒副作用，另外还可能增加了肿瘤组织对射线的敏感性，因此，其具有成为新型抗癌中药的良好前景，而蝎毒分离多肽很可能是蝎毒中的一种有效、低毒的抗肿瘤成分。 蝎毒成分复杂且功能各异，各成分中有对肿瘤细胞起抑杀作用，也有对正常细胞杀伤的，而且其机制目前尚未有完全明晰，本实验将东亚钳蝎蝎毒粗毒成分进行多次分离纯化，筛选其中高效的蝎毒成分，观察其对肿瘤的影响，只有成分确定，纯度高，才有可能客观研究其作用的效果以及机制。 目的：本次实验将东亚钳蝎蝎毒通过分离纯化后提取其中的抑癌成分，减少其中可能致过敏和毒性成分，观察其对Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠肿瘤生长、生存期、肺部转移以及肿瘤抑制率的影响。 方法： 一、东亚钳蝎蝎毒多肽的分离纯化及其组分的抗肿瘤效果筛选研究 1.应用凝胶层析法对蝎毒粗毒进行分离纯化，主要采用SephadexG-50进行分子筛分离成7个组分，本次分离纯化与本研究所赵灿国[2]论文所述的步骤与结果重复性高，而该论文中对分离的组分已进行了对人骨髓细胞白血病细胞HL-60、人肺癌A549细胞、人低分化胃腺癌细胞BGC-823和人肝癌细胞SMMC-7721的MTT抑制率筛查，其中发现第Ⅴ组分对A549肿瘤细胞抑制率最高的组分，故选之进行SephadexG-25脱盐并分别冻干保存。 2.将其中第Ⅴ组分以CMSephadexC-50阳离子交换树脂进行进一步分离，剃度式洗脱出各个组分，将各组分以SephadexG-25进行脱盐，然后冻干保存。 3.抗肿瘤活性筛选：将以上分离的组分，应用MTT法进行蝎毒粗毒进行抗肿瘤筛选工作，主要是对人肺癌细胞A549，筛选出其中抗肿瘤活性最高的组分。 二、东亚钳蝎蝎毒抗肿瘤组分对Lewis肺癌瘤源小鼠体内肿瘤影响及其机制探讨 1.测定已筛选的东亚钳蝎蝎毒组分的半数致死量LD50以确定Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠动物实验的剂量。取昆明种小鼠，18-22g,雌雄各半，腹腔注射由(1mg/ml-0.062mg/ml)¨个剂量，应用电脑统计软件DASver1.0(DrugAndStatisticsforWindows)Bliss法(正规LD50计算)。动物实验时，高剂量采用组分LD50的1/7，低剂量是1/15。 2.蝎毒组分对Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠生存期和肿瘤生长状况的影响实验：选择近交系C57BL/6小鼠48只，雌性，6周龄，体重16～18g，右腋下接种LLC细胞悬液0.2ml(含细胞数2×106个)建立肺转移模型。第7d肿瘤体表可触及时，用随机数字表法随机分为组，分别为①空白组，②高剂量、③低剂量、④顺铂组，开始用药后隔天观察体重，定期观察外周血白细胞计数；观察各组的生存期，定期测量腋下肿瘤的体积变化。 3.将上面实验效果较好的组分再进行肿瘤抑制实验，并加入与顺铂协同作用的一组。开始用药后隔天观察体重，定期观察外周血白细胞计数；定期测量腋下肿瘤的体积变化。种植肿瘤后21天将所有小鼠引颈处死，测量瘤重，鼠重，肺转移结节数量，肺、脾重量以及肿瘤的石蜡切片，HE染色观察，TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡比率。 结果： 1、东亚钳蝎粗毒经SephadexG-50分离可得到7个组分，其中抗肿瘤的重要组分第Ⅴ组分脱盐冻干保存后，进行CMSephadexC-50阳离子交换分离以及分别冻干，原粗毒共提取13种可能有肿瘤抑制作用的组分包括：Ⅳ、Ⅴ、Ⅴ-Ⅰ-Ⅱ、Ⅴ-Ⅱ-Ⅰ-②、Ⅴ-Ⅱ-Ⅱ-②、Ⅴ-Ⅱ-Ⅱ-③、Ⅴ-Ⅱ-Ⅲ-①、Ⅴ-Ⅱ-Ⅳ-①、Ⅴ-Ⅱ-Ⅴ-①、Ⅴ-Ⅲ-Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ需进一步筛选。 2、MTT筛选以上对肿瘤细胞抑制最强的两种动物实验的目标组分Ⅴ-Ⅱ-Ⅱ-②和Ⅴ-Ⅱ-Ⅲ-①，(下面将其简化为A和B组分)，(A)组分在10ug/ml时对A549细胞有18.93％的抑制率，(B)组分在1ug/ml时对A549细胞有14.81％的抑制率。 3、(A)和(B)LD50值经过测定后得到分别为(A)LD50=3.736±0.234mg/kg和(B)LD50=3.523±0.317mg/kg 4、Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠生存期和肿瘤生长状况的影响实验发现，(A)组分高、低剂量对肿瘤体积抑制率为分别为10.29％和9.35％，而(B)组分则分别为12.35和11.25％；在最后一天测得白细胞计数，(A)组分高、低剂量分别为82.36和85.23％，(B)组分能有效的恢复白细胞水平到接近正常水平95.37％和93.67％，而空白组和顺铂组的骨髓抑制情况严重，分别降低至正常水平的65.37％和35.28％。 5、选用上面实验效果良好的B组分进行动物肿瘤抑制实验，发现(B)组分能有效的与顺铂起协同肿瘤抑制作用，肿瘤重量和TUNEL法测凋亡指数比较，较单用顺铂组分别提高10.32％和11.74％，金氏方程显示q＞1，两药有协同作用；，同时协同组肿瘤肺转移率明显优于顺铂组，组间配对t检验，p＜0.05。结论： ①东亚钳蝎蝎毒分离组分Ⅴ-Ⅱ-Ⅲ-①有一定的Lewis肺癌肿瘤的抑制作用。 ②提高荷瘤小鼠生存期以及恢复荷瘤小鼠的外周血白细胞。 ③与常规化疗药顺铂合用，有效提高肿瘤抑制率，同时具有降低顺铂对骨髓抑制的副作用，有效抑制肿瘤肺部转移。