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我国是羊绒产量大国,且品种资源丰富,其中辽宁绒山羊是东北地区的一个本土品种,该品种遗传性状稳定,不仅产绒量高而且品质好,有“软黄金”的美誉。其羊绒产量最高记录分别为成年雄性1800克和成年雌性845克。羊绒是重要的纺织原料,但颜色相对单一,不能满足人们的生活需求。生产中,白羊毛因其可被染成不同的颜色而在纺织行业中具有较高的价值,然而,化学染料的应用不仅损害身体健康,还会造成环境污染。因此通过基因调控技术改变动物毛色,培育出更多自然色的产毛动物品种成为当前迫切需要解决的问题。MicroRNAs(MiRNAs)是一种单链非编码小RNA,长度为19-23个核苷酸,其参与转录后水平的靶基因调控,且对几乎所有动物器官的靶基因都可以进行微调。近年来,许多报道表明miRNAs在控制皮肤形态发生、毛囊发育和被毛颜色等方面发挥关键作用。研究者利用高通量测序技术检测发现,miR-27a在白色和棕色羊驼皮肤组织中有显著的表达差异,表明miR-27a可能参与动物毛色的形成。因此本研究选择miR-27a作为研究目标,探索其在绒山羊毛色形成中的作用。本研究首先通过荧光定量PCR技术验证miR-27a在白色和棕色绒山羊皮肤的表达情况,然后通过TargetScan预测miR-27a的靶基因,并通过GO和KEGG Pathway等生物信息学软件筛选出与毛色相关的靶基因;体内试验通过荧光定量PCR和Western blot分别检测靶基因mRNA和蛋白水平的表达及通过免疫组化检测靶蛋白在白色和棕色绒山羊皮肤的表达部位。之后体外试验利用双荧光素酶试验鉴定miR-27a与其候选靶基因之间的靶位点;用miR-27a模拟物(mimics)转染HEK293T细胞后,鉴定候选靶基因mRNA和蛋白水平的表达情况。通过以上研究来阐明miR-27a在绒山羊毛色形成中的作用,为之后的人工改变动物毛色提供理论依据。研究结果如下:1.荧光定量PCR检测miR-27a在白色和棕色绒山羊皮肤组织的表达水平,结果显示,miR-27a在白色绒山羊皮肤的表达显著高于棕色绒山羊皮肤。2.利用TargetScan预测miR-27a的靶基因并通过GO与KEGG pathway筛选出与毛色形成相关的,分别是WNT3A、KITLG。3.荧光定量PCR分析WNT3A和KITLG mRNA在白色和棕色绒山羊皮肤的表达,结果表明,WNT3A和KITLG mRNA在白色皮肤的表达显著低于棕色皮肤。4.蛋白水平的检测,Western blot结果显示:WNT3A和KITLG蛋白的表达在白色绒山羊皮肤显著低于棕色绒山羊皮肤。5.免疫组化的结果显示:WNT3A、KITLG蛋白在绒山羊皮肤组织的表皮(基底层)和内、外根鞘均有表达,但在白色皮肤组织的表达量明显低于棕色皮肤,且在棕色皮肤组织的毛乳头也有WNT3A、KITLG蛋白的表达。6.利用酶标仪检测白色和棕色绒山羊皮肤的黑色素含量,发现白色绒山羊皮肤组织的黑色素含量明显低于棕色绒山羊皮肤。7.双荧光素酶试验分别鉴定miR-27a同WNT3A或KITLG的结合位点,结果显示:试验组(psiCHECK2-WNT3A/KITLG-WT和miR-27a mimics共转染)的荧光素酶活性显著低于对照组(psiCHECK2-WNT3A/KITLG-WT和阴性对照共转染)的荧光素酶活性,证明WNT3A和KITLG是miR-27a的靶基因。8.在体外试验中,用miR-27a模拟物(试验组)和阴性对照分别转染HEK293T细胞后,在mRNA水平检测miR-27a及靶基因的表达,结果显示:miR-27a在试验组的表达显著高于阴性对照组,但是靶基因mRNA水平的表达与之相反。在蛋白水平的检测显示:靶蛋白的表达与靶mRNA的表达一致。由上可知,miR-27a通过下调WNT3A及KITLG的表达参与绒山羊毛色的调控,该试验为通过基因调控改变动物的毛色,培育更多自然色的产毛动物品种提供了理论依据。