假单胞菌利用生物柴油副产物甘油合成PHA研究

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近年来,石油危机、能源紧缺的问题日益严峻,世界各国正积极研发太阳能、风能、水能、生物质能等可再生的替代能源。生物柴油作为一种极有前景的可再生能源,受到全世界学术界和产业界的普遍关注。然而,生物柴油在生产过程中会产生大量的副产物(以甘油为主)。根据美国国家生物柴油协会的信息,预计2020年全球生物柴油市场将达1200万吨。副产物过度积累会带来废水、废气等环境污染的问题及对传统甘油市场的巨大冲击。如何利用新工艺和新技术加工处理生物柴油副产物,研究和开发高附加值新产品,成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates, PHAs)是许多微生物在C、N源失衡条件下,作为胞内碳源和能源储存物而大量积累产生的高分子聚合物,具有良好的热可塑性、生物相容性和可降解性,被广泛应用在环境友好型材料、组织工程、药物可控缓释载体等各个方面。利用微生物合成具有高附加值生物材料PHA是当前的研究热点。然而PHA合成过程中原料成本居高不下一直制约其发展。假单胞菌是PHA生产的优良菌株,可利用不同碳源为原料合成PHA,生物柴油副产物是非常好且便宜的PHA合成的原料。以生物柴油副产物为原料合成PHA,对于解决生物柴油副产物过度积累的问题具有重要意义。本研究利用本实验室筛选得到的假单胞菌Pseudomonas oleovorans ZJ03为出发菌株,利用紫外诱变结合Nile Red随机定向筛选可利用甘油的高产PHA菌株,并通过气相色谱法(GC)进一步分析确认。本研究还利用基因工程手段从不同的假单胞菌中克隆到了I型和II型PHA合酶基因,将其通过接合转化转入到Ralstonia eutropha PHB-4合酶缺失突变株中分析确认功能。具体研究结果如下:1)本研究为解决PHA产率低的问题,以P. oleovorans ZJ03为出发菌株,利用紫外随机诱变、定向筛选,根据紫外光下Nile Red荧光强度与假单胞菌PHA产量成正比的原理结合气相色谱法筛选可利用甘油的高产PHA假单胞菌突变株。共进行了两次诱变,第一次诱变之后,转菌过程可能受人为因素的影响,生长缓慢,荧光强度对比效果不是很好,得到了三株菌,其中A1为正向突变,A3、A8为负突变,其PHA含量分别为34.29%、10.98%和13.67%,与野生型比较提高的较少。第二次诱变采用直接涂布于选择培养基中培养,在紫外光下挑取荧光强度较高的菌株培养,得到的PHA含量从24.59%提高到44.67%,得到PHA产量突变株,但在平行性和稳定性上稍差,在下一步工作中进一步优化条件以期得到稳定高产PHA突变株。2)I型PHA合酶基因的克隆:通过I型合酶基因序列比对分析,该基因具有高度保守性。从而设计引物利用PCR技术,从P. oleovorans ZJ03基因组中克隆PHA合酶基因,将基因亚克隆到表达载体pBBR1MCS2中,通过化学转化的方法转化到Escherichia coli S17-1中,经酶切验证及测序结果比对,得到I型合酶基因。以E. coli S17-1为供体菌,Ralstonia eutropha PHB-4为受体菌,经接合转化将表达载体转化到R. eutropha PHB-4合酶缺失突变株中,通过重组菌的发酵并结合GC分析确认基因的功能。研究结果表明,重组菌可利用果糖、葡萄糖酸钠产生PHB,其含量分别73.88±3.80%和63.09±1.18%,证明基因的功能。3)II型PHA合酶基因的克隆:通过II型合酶基因序列比对分析,该基因具有高度保守性。从而设计引物利用PCR技术,从Pseudomonas corrugata YF388基因组中克隆PHA合酶基因,将基因亚克隆到表达载体pBBR1MCS2中,通过化学转化的方法转化到E. coli S17-1中,经酶切验证及测序结果比对,得到II型合酶基因。以E. coli S17-1为供体菌,R. eutropha PHB-4为受体菌,经接合转化将表达载体转化到R. eutropha PHB-4合酶缺失突变株中。经测序结果比对及酶切验证,表达质粒构建成功,为进一步验证其功能提供理论基础。综上所述,本研究成功获得高产PHA假单胞菌,且克隆I型和II型合酶基因,构建表达载体,并在宿主菌R. eutropha PHB-4中确认分析功能,为今后利用定点突变技术和嵌合酶构建技术扩大合酶的底物范围及改变PHA单体组成的可能性提供理论基础。
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