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研究背景与目的:胃肠外营养（Parenteral nutrition,PN）是维持生命的必要措施,在部分有胃肠道功能障碍的新生儿需给予全胃肠外营养（Total parenteral nutrition,TPN）治疗,如患有坏死性小肠结肠炎（NEC）、肠闭锁、短肠综合征（SBS）及胃肠道手术后的患儿。但是,TPN使用可引起多种并发症,其中以胃肠外营养相关性胆汁淤积（Parenteral nutrition associated cholestasis,PNAC）较为常见,严重者可引起肝纤维化、肝硬化及肝衰竭,甚至死亡,但发病机制尚不清楚。TPN液是由脂肪乳、葡萄糖、氨基酸、维生素等混合营养素组成,容易被氧化,成为新生儿促氧化剂的重要来源。环境条件可以诱导TPN液中氧化分子的产生,包括光照和/或光疗、暴露于氧气等,但新生儿的抗氧化系统并不成熟,因此新生儿面临一个更高的氧化应激风险,动物实验证实TPN液中的氧化物可引起肝细胞损伤、胆汁淤积、细胞凋亡和肺纤维化等,临床研究表明在25至32周的早产儿中,输注7天SMFlipid或Clin Oleic（精制大豆油20%和精制橄榄油的混合物）后发现了氧化应激反应,另一项研究表明与输注避光TPN液的动物相比,输注暴露于光的TPN液的豚鼠肝脏脂肪变性更多,肝脏损伤更重,异前列腺素F2α浓度升高,因此氧化应激在PNAC发病中起重要作用。线粒体是体内活性氧产生的重要场所,线粒体核糖体蛋白（Mitochondrial ribosomal protein,MRP）家族参与机体多种病理生理过程。MRPL35是线粒体核糖体的调节亚基,在细胞色素c氧化酶复合体（COX）的合成和组装方面起关键作用,协调蛋白质合成和氧化磷酸化（OXPHOS）系统的组装。研究表明MRPL35下调可导致活性氧（Active oxygen species,ROS）大量产生,诱导氧化损伤。ROS能激活细胞外信号调节jun N-末端激酶（c-JNK）等,进而活化NF-κB等炎症通路。基于肝脏的炎性损伤是新生儿PNAC的关键因素,由此我们推测MRPL35调节ROS产生,进而影响到JNK/NF-κB信号通路,可能是新生儿PNAC发病的重要机制。为验证此假说,我们拟利用基因过表达等生物学技术,研究MRPL35/ROS/JNK/NF-κB信号通路在PNAC发病中的作用及机制。所得的实验结果不仅可以阐明新生儿PNAC发病的新机制,还可为新型治疗手段的研发提供新靶点。材料与方法:1、研究对象（1）6～8周龄SPF级Sprague-Dawley雄性幼鼠（体重220～240 g）。（2）2021年8月到2022年2月期间在重庆市陆军军医大学第一附属医院儿科住院并予PN超过14天新生儿23例。2、方法（1）将6～8周龄SPF级Sprague-Dawley雄性幼鼠24只随机分为四组（n=6）:正常组、对照组、TPN-7d组和TPN-14d组,建立TPN动物模型,分别在建模第14天、14天、7天、14天处死幼鼠获取正常组、对照组、TPN-7d组、TPN-14d组幼鼠的心脏组织,同时留取正常组、对照组、TPN-14d组幼鼠的肝组织及外周血标本。全自动生化仪检测幼鼠肝功能指标,比色法检测幼鼠血浆及肝组织中氧化应激水平MDA、ROS、SOD酶活力、GSH-p X酶活力,DCFH-DA活性氧荧光探针结合荧光显微镜成像检测外周血单个核细胞及肝组织中ROS情况,酶联免疫吸附法（ELISA）分别检测幼鼠血浆中促炎因子IL-1β、TNF-α,抗炎因子IL-4、IL-10水平,免疫组化染色观察肝组织中TNF-α和IL-10表达情况,苏木精-伊红（HE）染色观察肝脏组织病理变化,流式仪检测各组幼鼠外周血单个核细胞及肝组织中细胞凋亡情况;比色法检测幼鼠心肌组织中氧化应激水平MDA、H2O2含量,实时定量PCR（q RT-PCR）检测心肌细胞髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）表达情况,蛋白质印迹法（WB）检测心肌细胞MPO蛋白表达情况,苏木精-伊红（HE）染色观察心脏组织病理变化,TUNEL染色法检测幼鼠心肌组织中细胞凋亡情况。（2）将23例新生儿据PN超过14天是否发生PNAC分为非PNAC组和PNAC组,临床基本资料收集包括:患儿胎龄、性别、出生体重、PN使用时间和肝功能指标,收集患儿外周血液,比色法检测新生儿外周血单个核细胞中氧化应激水平（MDA、ROS、SOD酶活力、GSH-p X酶活力）,DCFH-DA活性氧荧光探针结合荧光显微镜成像检测新生儿外周血单个核细胞中ROS情况,ELISA检测血浆中促炎因子IL-1β、TNF-α和抗炎因子IL-4、IL-10表达水平,流式仪检测新生儿外周血单个核细胞凋亡情况,q RT-PCR检测新生儿外周血单个核细胞中MRPL35 m RNA表达情况,Western-blot检测新生儿外周血单个核细胞中MRPL35、JNK、p-JNK、p65、p-p65蛋白水平表达情况,免疫荧光检测新生儿外周血单个核细胞MRPL35、JNK、p-65表达和分布情况。q RT-PCR检测正常组、对照组及TPN-14d组幼鼠肝组织中MRPL35 m RNA表达情况,Western-blot检测幼鼠外周血单个核细胞和肝组织中MRPL35、JNK、p-JNK、p65、p-p65蛋白表达情况,免疫荧光检测幼鼠外周血单个核细胞和肝组织中MRPL35、JNK、p-65表达。（3）选取6～8周龄SPF级Sprague-Dawley雄性幼鼠40只（体重220～240 g）随机分为四组（n=10）:PNAC组、PNAC+空载腺病毒组、PNAC+MRPL35过表达腺病毒组及PNAC+MRPL35过表达腺病毒+N-乙酰半胱氨酸（NAC）组,q RT-PCR检测各组幼鼠肝组织中MRPL35 m RNA表达情况,Western-blot检测各组幼鼠外周血单个核细胞及肝组织中MRPL35、JNK、p-JNK、p65、p-p65蛋白表达情况,免疫荧光检测各组幼鼠外周血单个核细胞和肝组织中MRPL35、JNK、p-65表达。全自动生化仪检测各组幼鼠肝功能,HE染色检测肝脏组织病理变化,流式仪检测各组幼鼠外周血单个核细胞及肝组织细胞凋亡情况,ELISA检测血浆中促炎因子IL-1β、TNF-α和抗炎因子IL-4、IL-10表达水平,比色法检测血浆MDA、ROS、SOD、GSH-p X,DCFH-DA活性氧ROS荧光探针结合荧光显微镜成像检测外周血单个核细胞及肝组织中ROS表达情况,免疫组化染色观察各组幼鼠肝脏组织TNF-α、IL-10表达情况,Western-blot检测外周血单个核细胞及肝组织中MRPL35、JNK、p-JNK、p65、p-p65蛋白表达情况,免疫荧光检测各组幼鼠MRPL35、JNK、p-65表达情况。3、统计学方法用SPSS 27.0统计软件对实验数据进行统计学分析,采用Graph Pad Prism 8.0作图。符合正态分布的计量资料以平均数±标准差(（?）±S)表示,多组间的均数比较采用一元方差分析（One-Way ANOVA）,均数之间的多重比较采用LSD方法（方差齐）或者Tamhane方法（方差不齐）进行,两独立样本比较采用独立样本T检验（符合正态分布）,计数资料以（%）表示;P＜0.05,差异有统计学意义。结果:1、与正常组和对照组比较,TPN-14d组幼鼠肝功能指标ALT、AST、GGT、TBA、TBi L、DBi L水平均明显升高（P＜0.05）,TPN-14d组幼鼠血浆中氧化应激指标MDA含量、ROS含量及ROS免疫荧光强度均明显增高（P＜0.05）,抗氧化水平SOD酶活力、GSH-p X酶活力升高（P＜0.05）,与正常组和对照组比较,TPN-14d组幼鼠血浆和肝组织中促炎因子IL-1β、TNF-α表达明显增高（P＜0.05）,抗炎因子IL-4、IL-10表达明显下降（P＜0.05）,TPN-14d组幼鼠肝脏组织出现明显坏死、肝小叶结构破坏,假小叶形成,TPN-14d组幼鼠外周血单个核细胞及肝细胞凋亡率均明显增高（P＜0.05）。与正常组和对照组比较,TPN-7d组心肌组织中MDA含量未见明显升高,差异无统计学P意义（P＞0.05）,而TPN-14d组心肌组织中MDA含量较正常组、对照组及TPN-7d组均明显升高（P＜0.05）,TPN-7d组和TPN-14d组幼鼠心肌组织中H2O2含量均明显升高（P＜0.05）,且TPN-14d组较TPN-7d组升高更明显（P＜0.05）,TPN-7d组心肌组织中MPO m RNA表达无明显升高,差异无统计学意义（P＞0.05）,而TPN-14d组MPO m RNA表达较正常组、对照组及TPN-7d组均明显升高（P＜0.05）,TPN-14d组及TPN-7d组MPO蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,且TPN-14d组较TPN-7d组升高更明显（P＜0.05）,心肌组织病理结果提示:正常组、对照组幼鼠心肌纤维形态正常,排列整齐,未见明显异常,TPN-7d组幼鼠心肌组织可见轻微间质出血和部分炎性细胞浸润,以中性粒细胞为主,TPN-14d组幼鼠心肌组织出现了轻到重度损伤,重度损伤表现为间质出血、水肿、血管扩张、心肌间隙增宽、少许坏死和大量炎性细胞浸润,以中性粒细胞、浆细胞、淋巴细胞为主。与正常组、对照组相比,TPN-7d组和TPN-14d组心肌细胞凋亡率均明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,且TPN-14d组心肌细胞凋亡率明显高于TPN-7d组。2、非PNAC组与PNAC组患儿在胎龄、性别、出生体重及PN使用时间差异无统计学意义（P＞0.05）。与非PNAC组比较,PNAC组患儿血清肝功指标AST、DBil、TBA水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,但ALT、TBil、GGT水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）;与非PNAC组比较,PNAC组患儿外周血单个核细胞凋亡率明显增高（P＜0.05）,促炎因子IL-1β、TNF-α表达明显增高（P＜0.05）,抗炎因子IL-4、IL-10表达下降（P＜0.05）,氧化应激水平MDA含量、ROS含量及ROS免疫荧光强度表达均增高（P＜0.05）,抗氧化能力SOD酶活性、GSH-p X酶活性升高（P＜0.05）,MRPL35m RNA、MRPL35蛋白及MRPL35免疫荧光表达均下降（P＜0.05）,JNK、p-JNK、p65、p-p65的蛋白及免疫荧光表达均增高（P＜0.05）。与正常组、对照组幼鼠比较,TPN-14d组幼鼠肝组织MRPL35 m RNA表达下降（P＜0.05）,TPN-14d组外周血单个核细胞及肝组织中MRPL35蛋白及MRPL35免疫荧光表达均下降（P＜0.05）,JNK、p-JNK、p65、p-p65的蛋白及免疫荧光表达均增高（P＜0.05）。3、在PNAC组和PNAC+空载腺病毒组可见肝细胞大量坏死,细胞排列紊乱,肝小叶结构破坏,大量假小叶形成,PNAC+MRPL35+组和PNAC+MRPL35++NAC组见肝细胞轻微肿胀、空泡,部分炎细胞浸润,但较PNAC组和PNAC+空载腺病毒组减轻,与PNAC组和PNAC+空载腺病毒组相比,PNAC+MRPL35+组和PNAC+MRPL35++NAC组MRPL35 m RNA、蛋白及免疫荧光表达均增强（P＜0.05）,肝功能指标ALS、AST、GGT、TBA水平均明显下降（P＜0.05）,PNAC+MRPL35++NAC组较PNAC+MRPL35+组下降更为明显（P＜0.05）,TBi L、DBi L水平各组间差异无统计学意义（P＞0.05）,PNAC+MRPL35+组和PNAC+MRPL35++NAC组中外周血单个核细胞和肝组织细胞凋亡率均明显下降（P＜0.05）,且PNAC+MRPL35++NAC组较PNAC+MRPL35+组更为明显（P＜0.05）,外周血血浆及肝组织中促炎因子TNF-α、IL-1β表达明显下降（P＜0.05）,抗炎因子IL-10、IL-4表达升高（P＜0.05）,且PNAC+MRPL35++NAC组较PNAC+MRPL35+组更为明显（P＜0.05）,氧化应激指标MDA含量、ROS含量及ROS免疫荧光强度均下降（P＜0.05）,PNAC+MRPL35++NAC组较PNAC+MRPL35+组更为明显（P＜0.05）,抗氧化能力指标SOD酶活性、GSH-p X酶活性下降（P＜0.05）,PNAC+MRPL35++NAC组与PNAC+MRPL35+组组间差异无统计学意义（P＞0.05）,PNAC+MRPL35+组和PNAC+MRPL35++NAC组p-JNK、JNK、p-65、p-p65的蛋白及免疫荧光表达均下降（P＜0.05）,PNAC+MRPL35++NAC组较PNAC+MRPL35+组更为明显（P＜0.05）。结论:1、TPN的长期使用会导致机体出现明显的氧化应激反应,伴炎症水平明显增加,导致肝脏和心肌损伤。2、在临床水平和动物模型水平证实MRPL35/ROS/JNK/NF-κB信号通路可能在新生儿PNAC中起重要作用。3、MRPL35通过ROS激活调控JNK/NF-κB信号通路,可能是新生儿PNAC发病的新的机制,有望成为治疗新生儿PNAC的新靶点。