【摘 要】
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目的:研究可释放降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）硼硅酸盐生物活性玻璃（Borosilicate bioactive glass,BBG）支架对巨噬细胞的促增殖极化作用后对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响,及其调控骨免疫对骨缺损修复作用影响。方法:体外细胞学实
【基金项目】
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项目名称:可释放CGRP的硼硅酸盐生物活性支架促进骨缺损修复的作用机制研究,项目合同编号:81860385,项目来源:国家自然科学基金资助项目,项目起止时间:2019年01月01日--2022年12月31日；
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目的:研究可释放降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）硼硅酸盐生物活性玻璃（Borosilicate bioactive glass,BBG）支架对巨噬细胞的促增殖极化作用后对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响,及其调控骨免疫对骨缺损修复作用影响。方法:体外细胞学实验:（1）首先将材料BBG-CGRP或BBG与DMEM培养基按照固液比为1g/10ml进行制备浸提液。实验分组:空白对照组、BBG组、BBG-CGRP组;然后将材料浸提液与小鼠腹腔巨噬细胞进行共培养。用CCK8法检测巨噬细胞的增殖情况,用SEM扫描观察巨噬细胞黏附形态;用流式细胞术和免疫组化荧光染色检测巨噬细胞M1/M2的表面抗原表达情况;用ELISA检测炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-1ra）的分泌;用RT-PCR检测相关基因的表达（炎症基因:IL-1β、IL-6、IL-10和IL-1ra;促成骨相关基因:TGF-β1、TGF-β3、VEGF、BMP-2）;（2）将材料巨噬细胞条件培养液与小鼠骨髓间充质干细胞（m BMSCs）进行共培养。用碱性磷酸酶活性、碱性磷酸酶染色及茜素红染色法检测细胞条件培养液对m BMSCs的成骨分化及细胞外基质矿化能力影响;采用RT-PCR检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、I型胶原（Collagen I,COLL-1）、骨钙素（Osteocalcin,OCN）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）等成骨相关基因m RNA的表达;采用Wstern Blot检测（ALP/OPN）等成骨相关蛋白的表达。动物学实验:实验分组:BBG组、BBG-CGRP组、自体骨组;建立兔子胫骨大段骨缺损模型,将BBG-CGRP玻璃支架、BBG玻璃支架和原位自体骨分别植入骨缺损区域,术后1、3、6个月定期进行X线检测、HE染色、亚甲基蓝酸性品红染色检测新生骨生长与材料降解的情况。结果:（1）体外细胞学实验:SEM扫描结果显示各组巨噬细胞呈圆形或椭圆型。CCK8实验证实了相较于对照,BBG和BBG-CGRP可促进巨噬细胞增殖,差异具有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞学实验、免疫组化荧光染色及炎性相关基因表达实验共同证实了BBG及BBG-CGRP可促进巨噬细胞向M2巨噬细胞方向进行极化,并且BBG-CGRP的促进作用较BBG更加明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）。ALP活性、ALP染色、茜素红染色、成骨基因及Wstern Blot实验共同表明,BBG和BBG-CGRP的巨噬细胞培养液均能促进m BMSCs向成骨方向分化,且BBG-CGRP的巨噬细胞培养液成骨效果更显著,差异具有统计学意义（P＜0.05）,表明BBG-CGRP的巨噬细胞培养液中包含的细胞因子有利于m BMSCs的定向成骨分化作用。（2）根据动物学实验术后X线结果、HE染色、亚甲基蓝酸性品红染色的结果发现术后3个月及6个月BBG-CGRP周围有较多的新生骨组织形成与自体骨的成骨能力基本一致,且成骨能力优于BBG组,表明BBG-CGRP比BBG有更好的骨修复效果。也表明了BBG-CGRP在体内可促进骨的再生修复。结论:CGRP负载于BBG具有调节巨噬细胞沿着M2方向极化并调控炎症因子释放的作用,营造良好成骨微环境,促进了骨再生。BBG-CGRP有可能是未来研究骨免疫的一个方向之一。
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