论文部分内容阅读
目的:通过对人视网膜色素上皮(Human retinal pigment epithelium,ARPE-19)细胞培养的体外实验,探讨外泌体信号通路对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ及其mRNA、下游因子P62蛋白表达的调控,和与自噬密切相关的补体因子C5b-9蛋白、C3a的mRNA表达水平,在此基础上对照观察杞黄颗粒的干预作用,进而为杞黄颗粒治疗年龄相关性黄斑变性提供更为系统和科学的理论依据。方法:1 ARPE-19细胞来源外泌体的提取及鉴定。培养正常ARPE-19细胞,取生长良好的ARPE-19细胞进行蓝光照射,制造氧化应激损伤模型。应用超速离心法分离正常及蓝光照射的ARPE-19细胞培养液,获取上清中的外泌体,采用蛋白免疫印记法(Westernblot,WB)检测外泌体表面特异性标志蛋白CD63表达水平以鉴定外泌体的来源。2 取 20mg/ml、15 mg/ml、10 mg/ml、8 mg/ml、4 mg/ml、2 mg/ml,6 个浓度的杞黄颗粒药液。用噻唑蓝法(MTT)确定杞黄颗粒的加药浓度。3 ARPE-19细胞来源外泌体对RPE细胞自噬效应的调控及杞黄颗粒干预研究。实验分组及处理:实验共分7组,空白对照组(正常ARPE-19细胞常规培养,不加任何外泌体及药物干预),正常模型组(正常ARPE-19细胞的外泌体+正常ARPE-19细胞共同培养),光照模型组(蓝光照射ARPE-19细胞的外泌体+正常ARPE-19细胞共同培养),药物对照1组(正常模型组+叶黄素药液),药物对照2组(光照模型组+叶黄素药液),实验药物1组(正常模型组+杞黄颗粒药液),实验药物2组(光照模型组+杞黄颗粒药液),每组n=6。药物作用24小时后,使用细胞计数板在显微镜下进行活细胞计数,观察各组细胞形态并拍照,MTT法检测各组ARPE-19细胞的增殖活性。4各组RPE细胞自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ及其下游因子P62蛋白、及与RPE细胞自噬密切相关补体因子C5b-9蛋白的表达量采用Western blot检测。LC3-Ⅱ及RPE细胞自噬密切相关补体因子C3a蛋白的mRNA表达水平用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测。结果:1通过Western blot法可检测到外泌体表面特异性标志蛋白CD63的表达,说明外泌体来源于ARPE-19细胞。2通过MTT法可知,当杞黄颗粒的浓度为4.3 mg/ml时细胞活性可达到85%。3蛋白相对表达量检测结果示:(1)P62蛋白:实验药物2组与空白对照组、药物对照1组、药物对照2组相比,数据明显升高,P值分别为0.005、0.022、0.009,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;实验药物1组与空白对照组、药物对照2组相比,数据明显升高,P值分别为0.031、0.049,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;余各组两两比较无统计学差异。(2)LC3-Ⅱ蛋白:正常模型组LC3-Ⅱ蛋白表达量高于药物对照2组、实验药物2组,P值分别为0.024、0.038,P值均小于0.05,差异具有统计学意义。余各组两两比较无统计学差异。(3)C5b-9蛋白:整体检验在样本间未显示出显著差异,各组两两比较无统计学差异。4mRNA相对表达量结果示:(1)LC3-ⅡmRNA:光照模型组与正常模型组相比,正常模型组的LC3-ⅡmRNA表达量高于光照模型组,P=0.008<0.05,差异具有统计学意义。余组间比较无明显差异。(2)C3a的mRNA:空白对照组相比正常模型组、药物对照1组、药物对照2组、实验药物1组、实验药物2组C3a的mRNA表达量,P值分别为0.00、0.00、0.030、0.00、0.00,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;正常模型组相比光照模型组、药物对照1组、药物对照2组、实验药物1组、实验药物2组的C3a mRNA表达量,P值分别为0.00、0.00、0.00、0.00、0.00,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;光照模型组相比药物对照1组、实验药物1组、实验药物2组的C3a mRNA表达量,P值分别为0.00、0.00、0.00,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;药物对照1组相比药物对照2组、实验药物1组、实验药物2组C3a的mRNA表达量,P值分别为0.00、0.001、0.002,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;药物对照2组相比实验药物1组、实验药物2组C3a的mRNA表达量,P值分别为0.00、0.00,P值均小于0.05,差异具有统计学意义;实验药物1组相比实验药物2组C3a的mRNA表达量,P值=0.00,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:1应用超速离心法能成功从ARPE-19细胞上清液中提取出外泌体,通过Westem blot检测到表面特异性标志蛋白CD63的表达,可证明外泌体来源于ARPE-19细胞。2通过MTT法确定了杞黄颗粒的加药浓度为4.3 mg/ml。3在氧化应激条件下,P62蛋白是自噬的关键调节剂,P62蛋白表达上调可刺激并促进自噬活性,对RPE细胞具有保护作用。外泌体及杞黄颗粒能上调P62蛋白的表达,且杞黄颗粒的疗效优于叶黄素,证明外泌体及杞黄颗粒上调P62蛋白的有效性。ARPE-19细胞来源的外泌体具有上调LC3-Ⅱ蛋白及LC3-ⅡmRNA的作用,从而提高RPE细胞自噬水平。C3a蛋白的高表达可沉积于RPE细胞基底层,促进玻璃膜疣形成。杞黄颗粒与叶黄素对C3a的mRNA水平均有明显的下调作用,且两种药物在细胞氧化应激的条件下较生理条件下更能下调C3a的mRNA水平,但杞黄颗粒对C3a的mRNA下调水平优于叶黄素。