兴安落叶松(Larix gmelinii)主要分布于我国东北地区,是森林生态系统中的优势树种,既能在高寒环境下生存,又能在复杂的逆境条件下正常生长,是研究植物抗逆基因的良好材料。几丁质酶是一种植物抗逆相关蛋白,特别是在植物抵御病害及低温的过程中发挥重要的作用,它具有热滞活性,能够降低冰点、抑制冰晶生长及重结晶,从而保护植物免受冻害。本研究以分析几丁质酶在兴安落叶松抵御低温中所发挥的作用,探讨其在提高转基因植物抗寒性中的可应用性为目的,通过RT-PCR技术克隆得到了一个兴安落叶松几丁质酶基因,命名为LgChi2。LgChi2 cDNA全长包含一个831bp的开放阅读框,编码276个氨基酸,蛋白分子量为28.4kDa,理论等电点为7.83,DNA全长为1395bp,包含两个内含子,三个外显子。系统进化分析显示,LgChi2与挪威云杉、花旗松、日本柳杉等植物的classIV几丁酶基因具有极高的同源性。利用基因枪法转化洋葱表皮细胞对LgChi蛋白的亚细胞定位进行分析的结果显示,LgChi::GFP融合蛋白定位于细胞边缘。表达特性分析结果显示,该基因主要表达在兴安落叶松的幼茎中,在4℃低温胁迫条件下,LgChi2的表达量明显增加,显示该基因为诱导型表达基因。同时,低温胁迫条件下兴安落叶松几丁质酶的活性呈先升高后下降的趋势,进一步显示几丁质酶基因在兴安落叶松抵御低温胁迫中发挥作用。为进一步分析该基因在植物适应低温胁迫中的应答机制,我们分别构建了真核的双元表达载体pBI101-LgChi和原核表达载体pET32a(+)-LgChi,并通过遗传转化的方法深入分析其在提高转基因生物抗寒性中的作用。结果表明,pET32a(+)-LgChi重组菌经SDS-PAGE电泳检测,观察到与预期大小一致的融合表达蛋白,同时,LgChi基因在大肠杆菌DE3中超表达,增强了细胞在低温胁迫下的生长速度。低温胁迫下,转LgChi基因拟南芥和野生型拟南芥的三种抗氧化物酶即过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)的活性均增加,但转基因拟南芥的增幅明显大于野生型拟南芥,显示该基因在提高转基因植物耐寒性中发挥重要作用。以上研究结果为进一步分析兴安落叶松几丁质酶基因的功能、表达调控机理及兴安落叶松的抗寒分子机制奠定了基础,同时也为利用兴安落叶松的几丁质酶基因进行农作物及林木的抗寒性遗传改良提供了有价值的候选基因。