论文部分内容阅读
研究背景肝细胞通过调节自身增殖、静息状态的相互转变参与肝脏发育、再生、损伤修复等多种重要的生理病理过程。然而肝细胞增殖启动、终止的具体信号机制尚不清楚。初步研究显示,活性氧（ROS）在此动态转换过程中,具有不同的反应和作用。实验目的通过不同发育时期的肝细胞模型和肝切除动物模型,研究生长发育及肝再生过程中ROS水平变化与肝细胞增殖-静息转变的关系,阐明ROS信号在诱导肝细胞增殖-静息转变过程中的关键地位及作用机制,为进一步认识肝细胞增殖-静息转变的自我调控过程,寻找新的调控靶点奠定基础。实验方法与研究方案1.观察大鼠肝脏发育过程中ROS的调控及ROS与肝细胞增殖→静息过渡的关系①分离不同发育阶段的肝细胞,检测ROS水平及细胞周期变化。②检测以Nrf2为核心的抗氧化产物的表达及活性变化。2.体外实验研究ROS调控肝细胞增殖周期开、关的量效关系①根据前期实验的观察结果,分别选择胎龄15-16天和成年SD大鼠的肝细胞作为研究对象进行原代分离培养。②通过直接干预增殖或静息肝细胞内的ROS水平,观察胞内ROS水平的改变对细胞增殖、细胞周期及CyclinD、Rb、PCNA表达的影响,明确ROS是否在肝细胞增殖-静息转变中起着信号调控作用,同时阐明其作用的剂量-效应规律。3. ROS对MAPKs的选择性磷酸化作用及ROS-MAPKs-CyclinD-Rb调控通路的研究①根据以上结果选择合适的干预剂量,通过降低增殖肝细胞内ROS水平诱导其静息或升高静息肝细胞内ROS水平诱导其增殖后,观察MAPKs磷酸化改变,证实ROS对MAPKs的选择性磷酸化激活作用。②干预胞内ROS浓度的同时,有针对性的采用特异性MAPKs抑制剂,观察胞内ROS水平、细胞增殖活性、细胞周期及相关蛋白表达、MAPKs磷酸化改变,进一步证实ROS信号的上游地位,探讨ROS-MAPKs-CyclinD-Rb调控通路在肝细胞增殖-静息状态转变中的作用。4.体内实验研究成年大鼠肝脏微环境H2O2水平变化对细胞静息状态的影响及作用机制。①GOX处理大鼠,在生理范围内升高肝脏微环境的H2O2水平,观察肝脏增殖能力及ERK活性改变,以证明ROS在肝细胞增殖自我调控机制中起“阀门样”作用。②在GOX处理的基础上给予CAT清除肝内H2O2,观察能否对抗GOX的效应,以证明GOX的促增殖作用与其肝内代谢产物H2O2直接相关。③在GOX处理的基础上给予MEK1/2选择性抑制剂PD184161,观察抑制ERK通路能否遏制GOX的增殖启动效应,以证明ERK通路激活是H2O2启动肝细胞增殖的重要机制。5.体内实验研究ROS信号对肝再生过程的调控采用成熟的大鼠70%肝切除模型,取不同时间点观察肝再生过程中ROS水平变化与肝组织增殖能力变化。同时正、反向干预肝再生早期的ROS水平,观察对肝再生及增殖相关信号通路的影响,探讨ROS平衡在肝再生启动中的作用。实验结果1. SD大鼠发育过程中,出生后15天,80%以上的肝细胞处于G0期,PCNA、Ki67、CyclinD、AFP表达下降,Rb磷酸化水平明显降低,说明出生后2周左右,SD大鼠肝细胞结束增殖、过渡至稳定的静息状态。我们的研究发现,线粒体是发育过程中肝细胞内ROS的主要来源,Nrf2及下游的抗氧化产物在不同的发育时期选择性表达,两者共同作用的结果为,伴随着肝细胞由增殖过渡到静息,ROS水平显著降低,提示ROS与细胞增殖-静息转变密切相关。2.采用NAC处理ROS水平相对较高的胚胎肝细胞,能显著降低ROS水平,抑制细胞增殖,诱导细胞静息,而p38抑制剂能显著阻断NAC诱导的细胞静息作用。采用H2O2处理ROS水平相对较低的成年肝细胞,能显著升高ROS水平,促进细胞增殖,而ERK抑制剂能显著阻断H2O2诱导的细胞增殖作用。以上结果说明,调控ROS可以通过选择性激活ERK或p38诱导细胞增殖或静息。3. GOX可使肝脏ROS水平增高,改变肝脏的静息状态,促进增殖。CAT可以降低ROS水平,阻断GOX的增殖启动作用,说明GOX的促增殖作用与其肝内代谢产物H2O2直接相关。ERK特异性抑制剂可以显著阻断GOX的促增殖效应,但效果弱于CAT,说明ERK通路只是ROS启动细胞增殖的调控通路之一。4. ROS水平在肝再生过程中变化先高后低,与肝切除后再生启动与终止密切相关。肝再生早期,GOX处理可以升高肝脏ROS水平,加重肝切除后氧化应激,抑制肝再生,而CAT处理可以降低肝脏ROS水平,减轻肝切除后氧化应激,但同样抑制肝再生。说明肝再生过程中的ROS水平被精确调控在“所需”范围内,可能是肝再生启动与进展的关键信号因素。结论:本课题通过观察正常肝脏发育及肝细胞再生过程中ROS的变化规律,探讨ROS信号改变与肝细胞增殖-静息相互转变的内在联系,从“ROS水平的相对高低是维持肝细胞增殖或静息状态所必需的”这一新视角出发研究肝细胞周期自我调控的实现途径,证明了“ROS信号诱导肝细胞增殖-静息转变”的理论假设,初步阐明了ROS剂量依赖性调控G0期启动、G1期关闭的具体分子机制,为肝再生、发育的调控研究提供新的方向和思路。