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肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IBS)是一种以腹痛或腹部不适为主要表现的功能性肠病,其发病机制尚未完全清楚,目前认为主要与内脏高敏感性及胃肠动力异常相关。多项研究证实内脏高敏感性与高水平的5-羟色胺(serotonin,5-hydroxytryptamine,5-HT)密切相关,5-羟色胺转运体(serotonin transporter, SERT)主要表达在肠上皮细胞膜、神经元突触等,对5-HT再摄取及灭活发挥作用,SERT其表达及功能异常可能是导致内脏高敏形成的重要机制。近期有学者发现表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)可在转录水平调控人肠上皮细胞SERT的表达及5-HT再摄取功能。而EGF与内脏高敏感形成的关系至今未明。本课题旨在通过乳大鼠醋酸灌肠建立慢性内脏高敏感模型,研究5-HT、SERT、EGF在内脏高敏感大鼠外周血及结肠组织中的表达,并分析EGF水平与SERT表达之间的关系。体外实验中进一步研究EGF对肠上皮细胞SERT表达及5-HT再摄取的影响。初步探讨EGF对SERT表达影响及其与内脏高敏感之间关系。[目的]1.检测内脏高敏感大鼠结肠及血清中EGF表达,并分析结肠组织中EGF水平与SERT表达间关系。2.应用大鼠肠上皮细胞系(IEC-6细胞)进一步探讨EGF对SERT表达及5-HT再摄取的影响及其可能机制。[方法]1.分组：新生Sprague-Dawley雄性乳大鼠20只,随机分成对照组,模型组,每组各10只。模型组大鼠于出生后第10-21天予以0.5%醋酸0.2m1灌肠,每日1次,为减少生理节律影响,均采用上午8：00进行灌肠,对照组大鼠每日予以相同体积生理盐水灌肠。2.验证成模：大鼠成长至第8周,行电极置入术,术后恢复1周,通过予以不同压力结直肠扩张(colorectal distension, CRD)刺激下,观察腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)评分及记录腹外斜肌肌电活动(electromyography, EMG)评估内脏敏感性。HE染色评估模型鼠及对照鼠结肠炎性改变情况。3.第9周观察AWR评分及记录EMG评估内脏敏感性；HE染色评估大鼠结肠炎症情况；ELISA方法检测对照组及模型组大鼠结肠及血清中5-HT及EGF含量；Western blotting法检测对照组及模型组大鼠结肠中SERT蛋白表达,并分析其与结肠中EGF含量的相关关系。4.细胞培养：大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6培养于10%FBS的高糖DMEM培养基。5.EGF对大鼠IEC-6细胞上SERT表达及再摄取5-HT功能的影响：IEC-6细胞经不同浓度和不同时间EGF刺激后,以qRT-PCR、Western blotting分别检测IEC-6细胞上SERT的mRNA和蛋白水平。为进一步证实EGF调控SERT作用是否通过其EGFR发挥作用,给予EGFR特异性抑制剂PD153035预先刺激,再给予EGF刺激后检测SERT蛋白及再摄取5-HT功能改变。[结果]1.内脏高敏感大鼠模型：与对照组大鼠相比,模型组大鼠在CRD刺激压力为40、60mmHg时,其AWR评分明显增高；在CRD刺激压力为40、60、80mmHg下,模型组大鼠EMG曲线下面积明显高于对照组；HE染色两组大鼠结肠组织均未见明显炎症改变。以上结果显示内脏高敏感模型建立。2.与对照组相比,模型组大鼠血清及结肠组织中5-HT水平明显增高(P<0.05),结肠组织中SERT蛋白表达下降；模型组大鼠血清及结肠组织中EGF含量明显低于对照组,并且通过Pearson’s方法对大鼠结肠组织中EGF含量及SERT蛋白表达量进行相关性分析发现两者存在显著正相关(r=0.820,P<0.001)。3.EGF可促进IEC-6细胞SERT mRNA和蛋白表达,以EGF浓度为40ng/L作用最为显著；在EGF (40ng/L)作用不同时间点,SERT表达的高峰时间为24h和48h。予以EGF(40ng/L)刺激IEC-6细胞24h,其氚标5羟色胺(3H-5-HT)摄取率明显高于对照组(P=0.021)。4.予以EGF(40ng/L)刺激IEC-6细胞24h,其氚标记5-羟色胺(3H-5-HT)摄取率明显高于对照组(P=0.021)。5.予EGFR特异性抑制剂预处理后加入EGF, SERT蛋白表达减低且3H-5-HT摄取率显著低于EGF组。[结论]EGF可影响SERT表达及5-HT再摄取降低,内脏高敏感大鼠EGF表达减低影响SERT表达,从而参与内脏高敏感形成。背景肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一种以腹痛及腹部不适为主要表现的常见的功能性肠病。目前IBS发病机制不明,治疗方法也较为局限,GLP-1受体激动剂能有效缓解IBS患者的腹痛,但缓解IBS患者腹痛的机制不明。Exendin-4是天然的GLP-1受体激动剂,血浆半衰期较长,达2.4小时。5-HT(5-hydroxytryptamine,5-HT)作为一种重要的神经递质,在内脏感觉的传递及调控中起着重要的作用,5-羟色胺转运体(serotonin transporter, SERT)是其灭活途径中重要的转运蛋白,可将5-HT摄取胞内进行降解。我们前期实验发现exendin-4可有效缓解内脏高敏感大鼠的内脏敏感性,该作用可能是通过促进肠上皮细胞SERT的表达进而促进5-HT再摄取降解途径实现。研究发现cAMP-PKA信号通路可调控SERT基因表达。因此本实验进一步通过探讨exendin-4是否是通过cAMP-PKA影响大鼠肠上皮细胞SERT的表达,进而影响5-HT功能。目的采用大鼠肠上皮细胞系IEC-6细胞,探讨exendin-4对IEC-6细胞SERT表达及对5-HT再摄取功能,并进一步分析该作用可能胞内分子机制。方法1.IEC-6细胞培养：培养于10%FBS的高糖DMEM培养基。2. Exendin-4对IEC-6细胞上SERT表达的影响：经不同浓度和不同时间点exendin-4刺激后,以qRT-PCR、Western blotting、氚标记的5-HT (3H-5-HT)同位素实验分别检测IEC-6细胞上SERT的mRNA和蛋白水平以及5-HT再摄取率。3.GLP-1受体抑制剂exendin-9对SERT表达的影响：IEC-6细胞经exendin-9预先处理后,Western blotting检测SERT蛋白改变。4.分别给予信号通路相关因子预处理IEC-6细胞,采用PKA活性检测试剂盒检测细胞内PKA活性,Western blotting检测SERT蛋白改变。结果1. Exendin-4呈浓度及时间依赖的增加IEC-6细胞上SERT蛋白及m RNA表达,并且能够促进细胞再摄取5-HT。2.GLP-1受体抑制剂exendin-9预处理后,IEC-6细胞SERT蛋白表达显著低于exendin-4组。3.腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)激动剂Forskolin可显著促进IEC-6上SERT蛋白表达,作用基本与exendin-4一致,而在预先给予AC抑制剂SQ22536和蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制剂H89处理细胞后,其SERT蛋白表达显著低于exendin-4组。4. Forskolin及exendin-4刺激细胞后,其胞内PKA活性显著增加,而预先给予SQ22536及H89组细胞内的PKA活性显著低于exendin-4和Forskolin组。结论Exendin-4可通过AC-cAMP-PKA信号通路促进肠上皮细胞上SERT蛋白表达,且可促进细胞对5-HT再摄取功能。