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配子发生是指由原始生殖细胞经有丝分裂、减数分裂形成成熟配子的复杂过程。其正常进行确保了遗传物质在生物世代间的稳定传递和变异,使物种得以繁衍和进化。因此,研究参与脊椎动物的配子发生的基因功能显得尤为重要。在哺乳类,核受体家族成员Dax1（Nr0b1）表达在精、卵巢生殖细胞和体细胞。功能研究发现,Dax1参与哺乳类精巢的精子发生,然而其是否参与卵子发生目前仍不清楚。本实验室的研究发现,在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）和象鲨（Callorhinchus milii）等少数鱼类中,存在两个dax1基因,命名为dax1和dax2,它们在性腺发育中功能目前鲜有报道。此外,在哺乳类,研究发现调控纤毛发生的关键因子叉头框家族成员Foxj1特异表达在睾丸的精子细胞。而该家族另一成员Foxh1特异地表达在卵巢的卵母细胞、鞘膜细胞和黄体。本实验室前期的研究发现,在罗非鱼,foxj1a表达在精巢的次级精母细胞,而foxh1表达在卵巢的I、II时相卵母细胞中。但是,还未见它们在性腺中的功能研究。基于以上的研究,推测foxj1a和foxh1可能参与到鱼类乃至脊椎动物配子发生过程。本研究以养殖鱼类罗非鱼为研究对象,利用基因编辑技术和建立的XY雄鱼次发性逆转（secondary sex reversal,SSR）模型,开展了dax1、dax2、foxj1a和foxh1在罗非鱼性腺发育和配子发生中的功能研究。本研究的结果如下:1、dax1和dax2的表达模式分析。5 dah（days after hatching）时,dax1在XX和XY鱼性腺中表达,但没有性差（p>0.05）。25-50 dah时,dax1在卵巢中的表达显著上调,随后逐渐降低（p<0.05）。75-180 dah时,dax1在精巢中的表达显著上调（p<0.05）。然而,5-30 dah时,dax1的复制基因dax2在XX和XY鱼性腺中几乎不表达（p>0.05）。90-180 dah时,dax2在卵巢中的表达显著上调,其在精巢中的表达相对较低（p<0.05）。此外,dax1表达于卵巢的卵母细胞、间质细胞以及精巢的精母细胞、支持和间质细胞中。而dax2主要表达在卵巢的I、II、III时相卵母细胞中。2、dax1纯合突变鱼的获得与性腺表型分析。dax1的靶位点位于其第1个外显子上,选择识别序列位于靶位点上的限制性内切酶Nla IV用于筛选dax1 F0代阳性鱼。待dax1 F0代XX鱼性成熟后,与野生XY鱼交配获得F1代。选择删除14 bp造成移码突变的dax1+/-XX和XY鱼交配获得F2代。在对照XX鱼,30 dah时,减数分裂起始,出现减数分裂相卵母细胞。然而,直到60 dah时,dax1-/-XX鱼才起始减数分裂。在对照XY鱼,90 dah时,减数分裂起始,出现初级、次级精母细胞。然而,直到150 dah时,dax1-/-XY鱼才起始减数分裂。这些结果表明,dax1突变导致罗非鱼减数分裂起始的延迟。此外,在dax1-/-XX和XY鱼性腺中,视黄酸（retinoin acid,RA）分解酶cyp26a1的表达显著上调,而合成酶aldh1a2和sycp3等减数分裂相关基因的表达显著下调（p<0.01或0.05）。并且,外源RA处理成功回救dax1-/-鱼的性腺表型和基因表达模式。这些结果表明,dax1通过影响RA的水平来参与减数分裂的起始。值得注意的是,当dax1-/-鱼恢复减数分裂时,dax2的表达显著上调（p<0.01）,说明dax2可能补偿了dax1在性腺中的功能缺失。3、dax2杂合突变鱼的获得与性腺表型分析。通过TALEN敲除dax2基因,靶位点位于第1个外显子上,选择识别序列位于靶位点上的限制性内切酶HpyCH4 III用于筛选dax2 F0代阳性鱼。待dax2 F0代XY鱼性成熟后,与野生XX鱼交配获得F1代。90 dah时,dax2+/-XX鱼的卵巢与对照鱼一样,充满I、II时相卵母细胞。180dah时,对照鱼卵巢中出现III、IV时相卵母细胞,且卵黄和脂滴开始积累。然而,在dax2+/-XX鱼卵巢的IV时相卵母细胞中未检测到卵黄和脂滴的累积,导致雌性不育,因此无法获得dax2纯合突变鱼。这些结果表明,dax2对卵黄发生期卵母细胞中卵黄和脂滴的累积十分重要。4、foxj1a的表达、纯合突变鱼的获得与表型分析。在本研究中,foxj1a在肾脏中的表达最高,此外在精巢也有表达,然而在其他组织中几乎不表达。且foxj1a表达在肾脏的肾小球和肾小管中。foxj1a的靶位点位于第2个外显子上,选择识别序列靠近PAM区（Protospacer adjacent motif,原型间隔基序）的限制性内切酶BsrB I用于筛选foxj1a F0代阳性鱼。待foxj1a F0代XY鱼性成熟后,与野生XX鱼交配获得F1代。然后,选择删除5 bp的foxj1a+/-XX和XY鱼交配获得F2代。3 dah时,foxj1a-/-鱼的身体侧弯、无法平游,导致8 dah时全部死亡。然而将其放入循环水系统中,使其随水流被动游动并获取食物,多数鱼可活至45 dah,少数鱼甚至活的更久。与野生鱼相比,foxj1a-/-鱼肾脏囊肿指数和肾脏/体重比值显著上调。90 dah时,对照XY鱼起始精子发生,精巢中出现初级和次级精母细胞,而foxj1a-/-鱼的精子发生延迟。210 dah时,foxj1a-/-鱼精子发生恢复。300 dah时,对foxj1a-/-鱼的精液镜检,观察到成熟的精子。但是,其精子形态异常、鞭毛变短且异常折叠,导致直线、曲线运动能力和精子活力显著降低和亚不育（p<0.01）。因此,foxj1a在肾脏的发育中具有重要作用。此外,在精巢精子鞭毛发生中也具有重要作用。5、foxh1纯合突变鱼的获得与卵巢表型分析。foxh1的靶位点位于第2个外显子上,选择识别序列靠近PAM区的限制性内切酶Hae III用于筛选foxh1 F0代阳性鱼。待foxh1 F0代XY鱼性成熟后,与野生XX鱼交配获得F1代。然后,选择插入4 bp造成移码突变的foxh1+/-XX和XY鱼交配获得F2代。90 dah时,和对照XX鱼一样,foxh1-/-鱼卵巢的充满I、II时相卵母细胞。180 dah时,对照鱼卵巢中出现III和IV时相卵母细胞,其被颗粒细胞和鞘膜细胞包围。然而,foxh1-/-XX鱼卵巢中卵母细胞的发育停滞在I和II时相,仅被单层的前颗粒细胞包围。卵泡发育停滞最终导致雌性不育。这些结果表明,foxh1可能在滤泡发生期卵泡的发育中具有重要作用。6、dax1、dax2、foxj1a和foxh1在XY鱼次发性逆转过程中的表达分析。利用类固醇激素合成酶的抑制剂TR（Trilostane,3b-HSD的抑制剂）、MN（Metopirone,11b-HSD的抑制剂）或GA（Glycyrrhetinic acid,Cyp11b2的抑制剂）与外源E2单独或同时处理30 dah的XY鱼至90 dah。在180 dah时,统计性逆转率发现,E2单独处理XY鱼的性逆转率为8.3%,TR、MN或GA单独处理鱼的性逆转为0.0%,而TR+E2、MN+E2和GA+E2处理鱼的性逆转率分别为88.8%、60.0%和47.6%。而且,其被添加的外源雄激素11-KT或MT（methyltestosterone）能成功回救。90 dah时,对照和11-KT回救组XY鱼起始精子发生,精巢中出现初级和次级精母细胞。而在TR、MN、GA和E2处理组,由于雄激素合成被阻断,导致精子发生延迟,精巢中只出现精原细胞。与此相一致,与对照组和11-KT回救组相比,TR、MN、GA和E2处理组精巢中dax1和foxj1a的表达显著下调（p<0.05）。然而,foxh1和dax2没有显著变化（p>0.05）,暗示dax1和foxj1a可能在精巢的精子发生中具有重要作用。而在TR+E2、MN+E2和GA+E2性逆转XY鱼中,其精巢组织中起始卵巢的分化,形成少数异位的卵母细胞。与此相一致,性逆转鱼性腺中dax1和foxj1a的表达显著下调,foxh1和dax2的表达显著上调（p<0.05）,暗示不同于dax1和foxj1a,foxh1和dax2可能在卵巢的的发育中具有重要作用。综上所述,利用TALEN和CRISPR/Cas9分别获得了dax1、dax2、foxj1a和foxh1的突变鱼。发现dax1可能通过调控罗非鱼RA的水平参与生殖细胞减数分裂的起始,且dax2对其有补偿作用。而dax2可能通过影响卵黄发生期卵母细胞中卵黄和脂滴的累积,参与雌鱼的卵子发生。此外,foxj1a除了影响肾脏的发育,还参与精巢精子发生的起始和精子的形变。而foxh1则可能参与滤泡发生期卵泡的发育。因此,dax1、dax2、foxj1a和foxh1在鱼类配子发生过程中的不同阶段发挥其生物学功能。