研究背景及目的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S.epidermidis)是寄生于人类体表的一种条件致病菌,具有毒力低、致病力弱等特点,也是引起院内感染的病原菌之一。近年来,随着外科植入物、中心静脉置管和人工心脏起搏器等生物材料的广泛应用,S.epidermidis所致生物膜相关感染已引起研究者的密切关注。细菌生物膜的严重危害在于:栖身于生物膜中的细菌的耐药性大大提高,传统抗菌药物难以杀灭这些细菌,并且往往导致生物材料相关治疗的失败。因此,研究S.epidermidis的生物膜形成,具有重要临床意义。抗菌药物是临床治疗细菌感染的重要手段。体内抗菌药物浓度低于最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC)而处于亚抑菌浓度(sub-MIC)状态,是抗菌药物治疗过程中不可避免的情况,因此,研究这种条件下抗菌药物对细菌生物膜形成的影响,对于进一步明确细菌生物膜形成过程及其影响因素、sub-MIC抗菌药物作用下细菌的生物学行为、特征及机制有着重要的科学意义,同时可为开发治疗生物膜感染的新型药物提供理论参考。大环内酯类药物是临床用于治疗敏感葡萄球菌所致感染的常用抗菌药物之一。本课题组前期研究发现,红霉素(erythromycin,ERY)、阿奇霉素(azithromycin,AZM)及克拉霉素(clarithromycin,CLR)在sub-MIC下,可诱导其耐药S.epidermidis菌株生物膜形成,但对其敏感S.epidermidis菌株生物膜形成的影响是否与耐药菌株相同,尚不清楚。最近研究显示,细菌生物膜的形成能力与其对抗菌药物的耐药表型具有相关性,但sub-MIC抗菌药物对细菌生物膜形成的影响是否也与细菌的耐药特征相关?目前尚未见文献报道。多聚糖胞间粘附素(polysaccharide intercellular adhesion,PIA)在S.epidermidis生物膜形成聚集阶段具有重要作用,PIA由N-糖基转移酶(N-glycosyltransferase,ica)基因簇编码的蛋白调控合成。细菌Lux S/AI-2(autoinducer-2,AI-2)群体感应系统、DNA结合蛋白Sar A及ica基因簇的上游基因ica R编码的Ica R蛋白均可调节ica A基因的转录表达或者PIA的分泌。虽有研究显示sub-MIC抗菌药物诱导S.epidermidis生物膜形成依赖于PIA合成增加,但其机制尚不清楚。本研究以sub-MIC ERY为干预因素,以临床分离S.epidermidis菌株为研究对象,首先进行生物膜形成能力的检测和亚抑菌浓度ERY对其生物膜形成的影响研究,结果发现sub-MIC ERY对生物膜形成的影响与菌株ERY耐药表型相关,为验证这种相关性,对11株ERY敏感株进行体外诱导耐药,使其突变为ERY耐药株,考察sub-MIC ERY对诱导耐药后菌株生物膜形成的影响;进一步研究发现耐药基因erm C的转录表达发生了显著变化,erm C的转录表达与ERY对S.epidermidis生物膜形成的影响相关;考察菌株PIA及其上游调控基因ica A、sar A、ica R、pfs及lux S的转录表达,发现群体感应系统的pfs基因的转录发生了显著变化,继而又对Lux S/AI-2群体感应系统的信号分子进行了考察。研究方法第一部分亚抑菌浓度红霉素对临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成的影响及其与细菌红霉素耐药表型的关系研究1.1对临床分离菌株最小抑菌浓度(MIC值)的测定采用“标准琼脂平板倍比稀释法”,以标准菌株S.aureus ATCC29213TM作为质控菌株,结果判读参照“2010版实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)”的标准进行,测定96株临床分离S.epidermidis菌株的MIC值。1.2细菌生物膜形成的观察方法采用结晶紫染色法观察1/4 MIC ERY对S.epidermidis菌株生物膜形成的影响并统计分析1/4 MIC ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜形成能力的改变与ERY耐药表型的相关性。根据实验室前期研究结果,如临床分离S.epidermidis菌株的生物膜OD值≥2倍标准菌株S.epidermidis ATCC12228TM的生物膜OD值,则认为该菌株具有生物膜形成能力。1/4 MIC ERY对临床分离S.epidermidis菌株生物膜形成的影响分为诱导、抑制或者不受影响三种类型,其区分标准如下:t检验比较各菌株ERY组与TSB对照组的生物膜OD值是否存在统计学差异。如果p<0.05且ERY组的OD值大于TSB组的OD值,则认为该菌株生物膜形成发生了诱导现象;如果p<0.05且ERY组的OD值小于TSB组的OD值,则认为该菌株生物膜形成发生了抑制现象;如果p>0.05,则不管ERY组的OD值大于还是小于TSB组的OD值,均认为该菌株生物膜形成未发生变化。对后续实验菌株的筛选标准是:生物膜形成能力强,生物膜形成被1/4 MIC ERY诱导或者抑制最明显,且标准差小的菌株。1.3使红霉素敏感菌株突变成红霉素耐药株的体外连续传代诱导法挑取单菌落,转种于含有1/4 MIC ERY的自制M-H培养皿上,37℃恒温培养24h-72 h。再次挑取单菌落,转种于含有1/2MIC(前一浓度的2倍)ERY的M-H培养皿上,按照相同条件培养24 h-72 h。此步骤重复至含有ERY的M-H培养皿上不再有菌落生长为止。取ERY最高浓度培养皿上生长的保存菌株,在无ERY的M-H培养皿上连续转种3次,取末次生长的菌株,测定其诱导后的ERY MIC值,再考察1/4 MIC ERY对这些菌株生物膜形成的影响。1.4实验菌株生物膜形成的剂量-效应和时间-效应考察条件剂量-效应实验,ERY的浓度范围为1/256 MIC~3/4 MIC;时间-效应实验,生物膜形成考察时间点为2 h、4 h、6 h、12 h和24 h。1.5实验菌株生长曲线的测定方法细菌培养0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h,然后取所培养菌液加入无色透明96孔平底培养板中,在酶标仪530 nm波长处测定各菌株菌液的OD值。如果测定值>3.0,则2倍稀释后再次测定,直至测定值在0.1~3.0范围内。菌液实际OD值=菌液平均OD值*稀释倍数。第二部分临床分离表皮葡萄球菌大环内酯类耐药基因分布及1/4最小抑菌浓度红霉素作用下erm基因的转录表达研究2.1聚合酶链式反应(PCR)鉴定临床分离菌株大环内酯类耐药基因的携带情况采用PCR法检测96株临床分离S.epidermidis菌株中erm A,erm B及erm C基因的分布情况,并对其中分布最广的erm C基因进行序列测定和同源性分析。2.2 1/4最小抑菌浓度红霉素作用下实验菌株erm C基因转录表达水平的时间-效应考察采用real time RT-PCR方法,考察与1/4 MIC ERY共同孵育0.5 h、2 h、6h、12 h和24 h,实验菌株SH04和SH10的erm C基因的转录表达水平受其影响的情况,分析erm C基因的转录表达水平变化与1/4 MIC ERY对实验菌株生物膜形成影响的可能关系。2.3 erm C基因转录表达水平与生物膜OD值比率的相关性分析根据erm C基因转录表达的时间-效应实验结果,随机抽取生物膜形成受1/4 MIC ERY抑制、诱导和不受其影响三种表型的菌株各8-9株,采用real time RT-PCR方法,考察与1/4 MIC ERY共同孵育2 h,各菌株erm C基因的转录表达情况,分析该因素与1/4 MIC ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜OD值与无ERY作用下S.epidermidis菌株生物膜OD值的比率之间的可能关系。第三部分多聚糖胞间粘附素及其上游调控子在1/4最小抑菌浓度红霉素影响临床分离表皮葡萄球菌菌株生物膜形成中的作用研究3.1双荧光染色法观察实验菌株生物膜形成及多聚糖胞间粘附素的分泌将盖玻片生长的生物膜固定晾干后用FITC-Con A和PI先后染色。激光共聚焦显微镜1000倍下,观察1/4 MIC ERY对S.epidermidis菌株生物膜形成过程及PIA分泌量的影响。其中标记为绿色荧光的是细菌多糖和标记为红色荧光的是细菌核酸(PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm)。3.2细菌多糖的检测方法采用硫酸-苯酚法测定实验菌株多糖的合成量,490 nm波长测定OD值(各样品稀释倍数为40倍)。3.3自诱导分子-2(AI-2)发光强度测定方法采用生物发光法考察Lux S/AI-2群体感应系统信号分子AI-2的合成情况,以上样后第3h的测定值作为各样本的发光强度值。主要研究结果第一部分亚抑菌浓度红霉素对临床分离表皮葡萄球菌菌株生物膜形成的影响及其与细菌红霉素耐药表型的关系研究1.临床分离表皮葡萄球菌菌株的红霉素耐药情况96株临床分离S.epidermidis中,85株为ERY耐药(MIC≥8 mg/L)菌株,耐药率为88.5%。其中15株MIC值在8~128 mg/L范围内,70株MIC值≥128 mg/L。2.1/4最小抑菌浓度红霉素对临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成的影响结果显示,96株临床分离S.epidermidis菌株均可形成生物膜。生物膜形成受1/4MIC ERY影响的菌株共27株,且都是ERY耐药菌株。其中4株生物膜形成发生了抑制现象(p<0.05),23株生物膜形成发生了诱导现象(p<0.05)。生物膜诱导菌株中,18株的生物膜诱导程度在1.11-2.0倍之间,5株的生物膜诱导程度大于2倍。其余58株ERY耐药菌株及11株ERY敏感菌株的生物膜形成均未受1/4 MIC ERY的明显影响。统计学分析发现,1/4 MIC ERY对临床分离S.epidermidis ERY耐药菌株和敏感菌株生物膜形成的影响,差异有统计学意义(p=0.031)。这提示,1/4 MIC ERY作用下,临床分离S.epidermidis菌株生物膜形成与菌株的ERY耐药表型相关。3.体外诱导耐药结果及1/4最小抑菌浓度红霉素对诱导耐药前后菌株生物膜形成的影响11株临床分离ERY敏感S.epidermidis菌株均被成功诱导成ERY耐药菌株,诱导耐药后的MIC值分布在16~256μg/ml范围。平行考察1/4 MIC ERY作用下,11株ERY敏感S.epidermidis菌株及其诱导耐药后菌株的生物膜形成情况,结果显示:诱导耐药后S.epidermidis菌株SH22、SH51和SH67的ERY组生物膜OD值与其对照组比较,明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);诱导耐药后S.epidermidis菌株SH40、SH46、SH52和SH77的ERY组生物膜OD值与其对照组比较,明显降低,差异有统计学意义(p<0.05)。原11株ERY敏感S.epidermidis菌株ERY组生物膜OD值与其对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。4.亚抑菌浓度红霉素对实验菌株生物膜形成影响的剂量-效应结果结果显示,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM在1/256 MIC~3/4 MIC ERY作用下,其ERY组生物膜OD值与对照组比较,差异均无统计学意义(p>0.05)。临床分离菌株SH04在1/4 MIC、1/2 MIC和3/4 MIC ERY作用下,其ERY组生物膜OD值与对照组比较,均明显降低,抑制程度分别为13.6%,17.1%和18.5%,差异有统计学意义(p<0.01);而1/4 MIC、1/2 MIC和3/4 MIC ERY组组间生物膜OD值比较,差异无统计学意义(p>0.05)。临床分离菌株SH10在1/128 MIC~3/4 MIC ERY作用下,其ERY组生物膜OD值与对照组比较,均明显升高,差异有统计学意义(p<0.01);而1/4 MIC ERY组生物膜OD值明显高于3/4 MIC、1/2 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32MIC、1/64 MIC和1/128 MIC ERY组,差异有统计学意义(p<0.01)。5.1/4最小抑菌浓度红霉素对实验菌株生物膜形成影响的时间-效应结果标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM各时间点ERY组生物膜OD值与对照组比较,差异均无统计学意义(p>0.05);临床分离菌株SH04与1/4 MIC ERY共同孵育4 h、6 h、12 h和24 h,其ERY组生物膜形成分别被抑制20.1%、19.5%、10.7%和13.6%,生物膜OD值与对照组比较,差异有统计学意义(p<0.01)。临床分离菌株SH10与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h和6 h,ERY组生物膜OD值与对照组比较,均明显减少,差异有统计学意义(p<0.01);与1/4 MIC ERY共同孵育12 h和24 h,其生物膜形成分别被诱导49.4%和99.7%,ERY组生物膜OD值与对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。6.1/4最小抑菌浓度红霉素对实验菌株生长情况的影响1/4 MIC ERY作用下,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM和临床分离菌株SH04ERY组24 h内生长情况与对照组相似(p>0.05);临床分离菌株SH10 ERY组2 h、3h、6 h、8 h和10 h时间点生长受到明显抑制(p<0.05),12 h和24 h时间点ERY组生长情况与对照组相似(p>0.05)。第二部分临床分离表皮葡萄球菌大环内酯类耐药基因分布及1/4最小抑菌浓度红霉素作用下erm基因的转录表达研究1.96株临床分离表皮葡萄球菌erm A、erm B及erm C基因的分布情况96株S.epidermidis菌株erm C基因的阳性扩增率为94.8%(91/96);erm A及erm B基因的阳性扩增率均为6.2%(6/96)。统计学分析结果提示,各基因的分布情况在生物膜形成不同影响类型临床分离S.epidermidis菌株之间无差异(p>0.05)。其中erm C基因在生物膜形成发生抑制、诱导和不受影响的S.epidermidis菌株中分布率分别为:100%、95.7%和94.2%。将各菌株扩增出的erm C基因产物进行碱基序列测定,并将测得的碱基序列在Pubmed NCBI基因库中进行同源序列比对,结果各菌株测得的碱基序列与NCBI基因库中的同源序列比较,同源性达99%,未发现有意义的突变位点。2.实验菌株erm C基因转录表达水平的时间-效应结果对临床分离S.epidermidis菌株SH04和SH10 erm C基因的转录表达水平进行时间-效应考察发现:在0.5 h、2 h和12 h时间点,生物膜抑制菌株SH04的erm C基因的转录表达发生明显抑制(p<0.05);在6 h时间点,该菌株erm C基因的转录表达发生明显诱导(p<0.05);在24 h时间点,该菌株erm C基因的转录表达发生抑制,但与对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。在0.5 h、2 h和6 h时间点,生物膜诱导菌株SH10的erm C基因的转录表达发生显著诱导(p<0.05);在12 h和24 h时间点,该菌株erm C基因的转录表达均发生抑制,但孵育12 h,ERY组erm C基因的转录表达与对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05);而孵育24 h,ERY组erm C基因的转录表达显著低于对照组(p<0.05)。3.erm C基因的转录表达水平与表皮葡萄球菌生物膜OD值比率的相关性根据erm C基因转录表达水平的时间-效应结果,本研究考察了25株ERY耐药S.epidermidis菌株与1/4 MIC ERY共同孵育2 h,erm C基因的转录表达情况,其中9株生物膜诱导菌株ERY组erm C基因的转录表达水平是对照组的0.5-2.46倍;8株生物膜抑制菌株ERY组erm C基因的转录表达水平是对照组的0.74-2.14倍;8株生物膜不受影响菌株ERY组erm C基因的转录表达水平是对照组的0.76-2.24倍。合并分析上述25株S.epidermidis菌株erm C基因的转录表达水平与相应菌株ERY组生物膜OD值和对照组生物膜OD值的比率之间的相关性,结果显示,上述两个变量之间几乎不具有直线相关关系(n=25,r=-0.07,R2=0.0044)。进一步分层统计分析发现:在生物膜形成诱导菌株中,erm C基因的转录表达水平与相应菌株ERY组生物膜OD值和对照组生物膜OD值的比率之间存在线性正相关关系(n=9,r=0.70,R2=0.4992);在生物膜形成抑制菌株中,上述两个变量之间存在线性负相关关系(n=8,r=-0.61,R2=0.3686);而在生物膜形成不受影响菌株中,上述两个变量之间仅存在非常微弱的线性正相关关系(n=8,r=0.21,R2=0.0512)。第三部分多聚糖胞间粘附素及其上游调控子在1/4最小抑菌浓度红霉素影响临床分离表皮葡萄球菌菌株生物膜形成中的作用研究1.双荧光染色法观察1/4最小抑菌浓度红霉素对实验菌株生物膜形成和多聚糖胞间粘附素分泌的影响双荧光染色法考察与1/4 MIC ERY共孵育6 h、12 h和24 h,各实验菌株生物膜形成和PIA分泌的变化情况,结果显示:标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM ERY组在各时间点生物膜形成及生物膜内绿色荧光强度均与对照组近似。临床分离株SH04ERY组在各时间点生物膜形成比对照组稀疏;而其生物膜内绿色荧光强度均比对照组弱。临床分离株SH10 ERY组在12 h和24 h时间点生物膜形成均比对照组致密,罕见空洞存在,其生物膜内绿色荧光强度均比对照组强;而在6 h时间点,其ERY组生物膜形成较对照组稀疏,而其生物膜内绿色荧光强度较对照组弱。2.1/4最小抑菌浓度红霉素对实验菌株多聚糖胞间粘附素分泌量的影响与1/4 MIC ERY共孵育6 h、12 h和24 h时间点,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM ERY组PIA含量与对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05);而临床分离S.epidermidis菌株SH04在6 h、12 h和24 h时间点,ERY组PIA含量较对照组明显减少,差异有统计学意义(p<0.01);临床分离S.epidermidis菌株SH10在12 h和24 h时间点,ERY组PIA含量较对照组明显增加,差异有统计学意义(p<0.05),但在6 h时间点,其PIA含量明显减少(p<0.01)。上述结果显示,各实验菌株PIA分泌量的变化情况与双荧光染色法观察到的1/4 MIC ERY作用下,其生物膜形成的变化情况和PIA的分泌情况相一致。3.1/4最小抑菌浓度红霉素对实验菌株多聚糖胞间粘附素合成调控相关基因转录表达水平的影响与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h、12 h和24 h,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM ica A基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。与1/4 MIC ERY共同孵育4 h、6 h、12 h和24 h,临床分离S.epidermidis菌株SH04 ica A基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,发生明显抑制,差异有统计学意义(p<0.05);而2 h时间点ERY组ica A基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。与1/4 MIC ERY共同孵育6 h、12 h和24 h时间点,临床分离S.epidermidis菌株SH10 ica A基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,发生明显诱导,差异有统计学意义(p<0.05);而2 h时间点ERY组ica A基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,发生明显抑制,差异有统计学意义(p<0.05);而4 h时间点ERY组ica A基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h、12 h和24 h,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM pfs基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05);与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h、12 h和24 h,临床分离S.epidermidis菌株SH04 pfs基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,发生明显诱导,差异有统计学意义(p<0.05);与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h、12 h和24 h,临床分离S.epidermidis菌株SH10 pfs基因的转录表达水平与同时间点对照组比较,发生显著抑制,差异有统计学意义(p<0.05)。同一时间点,不同菌株ERY组pfs基因的转录表达水平比较,差异有统计学意义(p<0.05)。与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h、12 h和24 h,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM、临床分离菌株SH04及SH10的lux S和ica R基因的转录表达水平均不受1/4 MIC ERY的影响(p>0.05)。与1/4 MIC ERY共同孵育4 h、6 h和12 h,各实验菌株sar A基因的转录表达水平均不受1/4 MIC ERY的影响(p>0.05);但在2 h时间点,菌株SH10 sar A基因的转录表达水平受到明显抑制(p<0.05);在24 h时间点,各实验菌株sar A基因的转录表达均受到明显抑制(p<0.05)。4.1/4最小抑菌浓度红霉素对实验菌株群体感应系统信号分子AI-2合成的影响采用生物发光法检测各实验菌株AI-2信号分子的合成情况,结果发现,标准菌株S.epidermidis ATCC35984TM ERY组AI-2发光强度与同一时间点对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05);与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h、8 h和10 h,临床分离S.epidermidis菌株SH04 AI-2发光强度与同一时间点对照组比较,明显增强,差异有统计学意义(p<0.05);与1/4 MIC ERY共同孵育2 h、4 h、6 h和8 h,临床分离S.epidermidis菌株SH10 AI-2发光强度与同一时间点对照组比较,明显减弱,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.1/4 MIC ERY对临床分离ERY耐药S.epidermidis菌株生物膜形成可产生诱导和抑制两种相反的作用。2.ERY耐药表型与1/4 MIC ERY对S.epidermidis菌株生物膜形成的影响具有一定相关性。3.erm C基因的转录表达水平可能与1/4 MIC ERY对S.epidermidis生物膜形成的影响具有线性相关关系。4.对PIA及其上游调控因子Lux S/AI-2群体感应系统的影响,可能是1/4 MIC ERY影响临床分离S.epidermidis菌株生物膜形成的重要机制之一。