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背景:牙髓病、根尖周病是造成牙体组织损伤的的常见病,在世界范围内均有较高的患病率。越来越多的基础和临床研究表明,牙体牙周损伤与全身健康有着密切的双向关系。 干细胞是一类具有多向分化潜能及较强增殖能力的细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能的细胞。干细胞按照其来源可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。2006年,日本学者通过转染特定的基因组合将已分化的体细胞重编诱导产生一种新型多潜能干细胞,这种干细胞称为诱导性多潜能干细胞。在牙齿再生修复的研究领域,成体干细胞、胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞均已开始应用。 胚胎干细胞来源于胚胎发育期的胚泡,可以在体外长期保持未分化状态,并具有分化为机体内任何一种体细胞的潜能,而成体干细胞则来源于已经发育成熟的组织,是一种多能干细胞或单能干细胞。 牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是存在于牙髓细胞(dental pulpcells,DPCs)内具有多向分化潜能及较强增殖能力的间充质干细胞,为广泛应用于牙体缺损修复研究的牙源性成体干细胞。DPSCs在龋损与牙髓损伤情况下作为替代成牙本质细胞的前体细胞,参与牙髓损伤修复。骨髓间充质干细胞(bonemesenchymal stem cells,BMSCs)是一类非造血来源的具有多向分化能力的干细胞。由于其具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能,且具有来源损伤小、易恢复、易培养等优势,成为目前备受关注的干细胞。研究发现,BMSCs生理状态下具有定向迁移到多种组织的能力,其迁移至损伤区的能力更强且具有促进损伤修复的功能。在牙髓损伤修复研究中,亦发现BMSCs具有参与牙髓牙周损伤修复的功能。亦有学者通过BMSCs移植证明其具有参与修复牙体、牙周组织缺损的能力。 干细胞的治疗作用涉及干细胞的存活能力,调节微环境和旁分泌,动员和募集宿主自身的干细胞参与组织再生。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的治疗效果并不只是通过分泌具有生物活性的因子实现的,移植的MSCs的另一个重要作用体现在其分化能力上。干细胞的定向分化为其发挥作用的重要方式,BMSCs可以根据其所处的环境主动转化为相应类型的细胞。有研究指出干细胞的分化不仅涉及细胞所处的化学微环境,物理微环境对干细胞分化的影响也有着重要作用。 综上所述,BMSCs这一具有促进牙髓及多种组织损伤修复能力的间充质干细胞,可能通过物理接触或者旁分泌方式对DPCs产生影响从而促进牙髓损伤修复,本实验通过BMSCs与DPCs体外共培养,探究两者共培养的可行性及其对细胞生物学性能的影响,为BMSCs的临床应用提供一定的理论依据。 目的:本研究通过体外共培养探究BMSCs与DPCs共存情况下对细胞生物学性能的影响,为牙齿组织工程学选择合适的种子细胞及骨髓间充质干细胞应用于临床牙髓病治疗提供理论依据。 材料与方法: 第一部分大鼠牙髓细胞的分离、培养 4w龄SD大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后脱颈处死,75%酒精浸泡15min,超净台内手术取出下颌骨后浸泡于75%酒精5min,用含双抗PBS溶液反复冲洗2-3遍洗净酒精后剔除下颌骨表而肌肉组织。用钳子夹碎硬组织,取出牙髓组织,剪除根尖1/3。将取得的牙髓组织剪成约0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小组织块后用含双抗的PBS溶液冲洗两遍,3mg/mLⅠ型胶原酶,37℃恒温振荡摇床消化约10min,至组织松散接触。加入少量培养液,轻轻吹打,800 rpm离心3min,弃上清,洗去胶原酶。用牙科探针将组织碎块移入培养瓶内,以0.5cm间距均匀铺于湿润的培养瓶底,向瓶内加入4mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,将培养瓶倒置,使组织块与培养基暂不接触,置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养,4h后轻轻翻瓶,3d常规换液。原代细胞生长融合至80%时,传代培养。 第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定 4w龄SD大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后脱颈处死,75%酒精浸泡消毒15min,超净台内手术取出胫骨、股骨,用含双抗PBS溶液反复冲洗2-3遍后剔除骨表面软组织。含双抗的PBS反复冲洗胫骨股骨,剪开股骨、胫骨干骺端。注射器吸取DMEM/F12培养基反复冲洗骨髓腔以及干骺端,至骨干呈白色。洗出液800rpm离心3min,离心后弃上清,吸取含10%FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞,1mL皮试针反复吹吸混匀细胞后移入25cm2培养瓶,37℃、5% CO2恒温培养箱培养。弃去半小时内贴壁的细胞,将暂未贴壁的细胞移至另一培养瓶,24h首次换液,以后每3-4d更换培养基。直到10d左右,细胞生长至约80%融合进行传代培养。去除原培养基,用无菌PBS缓冲液缓慢冲洗三次,加入1mL0.25%含EDTA的胰酶消化1min左右,在倒置显微镜下观察细胞形态的变化,当少量细胞变圆变亮即将慢慢脱离瓶底时,迅速加入2mL含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化,不吹打细胞,仅将已消化下来的细胞常规传代培养,弃去原培养瓶中未消化下来的细胞。 重复上述传代方法三次后,取第3代BMSCs,MTT法绘制细胞生长曲线;流式细胞技术鉴定细胞的间质干细胞表面标志物的表达情况;以3×105/孔密度接种在6孔板培养,待细胞生长密度达到80%后,加入DMEM/F12矿化诱导液(含10%FBS,0.1uM地塞米松,50uM维生素C,10mMβ-磷酸甘油),BMSCs矿化诱导14d后茜素红染色,倒置显微镜下观察成骨情况;以3×105/孔密度接种于6孔板中,待细胞生长密度达到80%后,更换为成脂诱导液(含10%胎牛血清的培养基加入1μM地塞米松,200μM消炎痛,0.5mM IBMX,10μg/mL胰岛素),隔3d换液。成脂诱导21d后,油红O混合液染色,倒置显微镜下观察脂滴的形成情况。 第三部分接触式共培养对细胞增殖及矿化能力的影响 分别将第3代BMSCs和DPCs以及两者1∶1比例混合细胞以5×103/孔的细胞量接种于96孔板,MTT法绘制细胞生长曲线比较接触式培养对细胞增殖的影响。分别将第3代BMSCs、DPCs以及两者1∶1比例混合细胞以3×105/孔密度接种于6孔板中,待细胞生长密度达到80%后开始矿化诱导。诱导7d,14d后,收集提纯各组总RNA,用qRT-PCR方法检测OCN,OPN,ALP,DSPP等矿化相关基因在mRNA水平的表达。对经诱导的各组细胞进行茜素红染色观察钙结节形成情况。 第四部分接触式共培养对细胞IL-1β分泌的影响 分别将BMSCs、DPCs及按1∶1比例混匀的混合细胞分为三组,以3×105/孔细胞密度接种于6孔板,接种后第3d细胞生长密度达到80%左右后,更换为含LPS浓度分别为10ng/mL、100ng/mL的含10%FBS的DMEM/F12培养基,阴性对照组不加LPS。将LPS刺激2h及对照组的细胞提取总RNA,进行qRT-PCR检测共培养对LPS刺激情况下细胞炎症相关因子表达的影响。 结果:1.成功分离培养大鼠牙髓细胞 改良组织块酶消化法原代培养3d左右,便有细胞从牙髓组织块周围迁出。大鼠牙髓细胞光镜下排列较为集中,形态以多边形为主,边缘处细胞生长较为稀疏,内部紧密处细胞较多。总体上细胞形态呈多角形,细胞成簇生长,胞质丰富,细胞核圆,居中。传代后细胞增殖较快,呈生长均匀的多角形、铺路石样细胞。 2.成功分离培养鉴定大鼠BMSCs 全骨髓贴壁法原代培养接种后镜下可见大量大小不一呈圆形或类圆形混合细胞;24h后便有细胞开始贴壁,第4d左右可见明显细胞克隆团块形成;约10d左右,细胞密度达到80%左右融合时,可进行传代培养。经三次传代后,细胞呈均一的长梭形,排列成漩涡状成纤维细胞样形态,间杂少量亮圆形细胞,总体上细胞形态一致性增高。培养获得的细胞具有良好的增殖能力及成骨、成脂能力。流式细胞标志物检测发现,造血干细胞表面表达的标志物CD34、CD45为阴性,阳性率低于1%,间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD90均为阳性,双峰。 3.体外接触式共培养对细胞增殖及矿化能力的影响 两种细胞以1∶1比例混匀接种,数小时后细胞贴壁良好,倒置显微镜下可见多角形细胞及长梭形细胞混合生长,生长状态良好。共培养组细胞增殖能力较单独培养组明显增强。qRT-PCR结果显示,矿化诱导1w到2w各组细胞均表达RUNX2、ALP、OCN、OPN等矿化相关基因,且表达量随着矿化时间的增长有增强趋势。其中矿化诱导第二周,BMSCs的RUNX2、ALP、OCN表达量显著升高,有显著性差异(P<0.05)。混合细胞组RUNX2、ALP未见明显升高,但OCN、OPN表达显著升高,且高于其余各组。矿化诱导培养14d后,DPCs表达牙源性矿化相关基因DSPP显著升高,混合细胞组有升高趋势,但无统计学差异。 4.LPS刺激接触式共培养的细胞对细胞IL-1β分泌的比较 qRT-PCR结果显示,BMSCs、DPCs及共培养组各组细胞在LPS刺激下表达IL-1β,且随着LPS剂量增加表达量增高。其中,DPCs组相对表达较低,混合细胞组表达量较高。 结论:1.运用改良组织块酶消化法培养出原代大鼠DPCs,获得的细胞具有较好增殖能力及良好矿化能力,为后续实验提供细胞学基础。 2.本研究通过相对直接的分离培养方法,培养出有较旺盛增殖能力的贴壁细胞,所获细胞的表型和生物学特性与BMSCs相符合,为后续实验提供稳定、可靠的细胞来源。 3.BMSCs与DPCs两种细胞共培养可以在不减弱成牙能力的基础上显著提高细胞增殖力及矿化能力,从而促进组织损伤修复,为BMSCs促进牙髓组织再生提供基础依据。 4.BMSCs与DPCs共培养可影响细胞的抗炎性能,具体作用方式及作用效果仍需进一步探索。