甲型H1N1流感为急性呼吸道传染病，与以往或目前的季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段，人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人传染人。2009年甲型H1N1流感在全球范围内大规模流行，给人们带来了极大恐慌。本研究目的是通过系统的试验设计及方案实施寻求一种更为安全、经济、可行的甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗的生产工艺，为甲型H1N1流感的预防提供一种全新的疫苗制备途径。本研究中，我们采用300目滤布对病毒鸡胚培养获得的尿囊液进行粗滤，再经连续流低速离心方法进行澄清。采用100-300KD超滤膜将澄清后的病毒尿囊液浓缩30-50倍，再经蔗糖密度梯度离心对流感全病毒进行纯化，去除病毒浓缩液中绝大多数卵清蛋白等杂质。在纯化后的病毒液中按1:2000加入甲醛，2-8℃灭活4天的方式进行病毒灭活。使用100KD超滤膜洗滤灭活后纯化病毒液，去除甲醛及蔗糖。将灭活的纯化病毒液通过100KD膜包超滤脱糖后，分别按终浓度1:4000加入Tween-80，4℃搅拌1小时，再按0.2%加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），裂解病毒2小时，通过IRC-50离子交换柱纯化；再利用IRC-50离子交换树脂柱进行裂解后的再次纯化，经PBS洗脱，最终获得甲型H1N1流感病毒原液。经过后续半成品配制，制备出疫苗成品。使用单向免疫扩散的方法检测疫苗的抗原含量及特异性鉴别，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测疫苗分子量及纯度，采用2010版《中华人民共和国药典》三部附录ⅥL法检测游离甲醛含量，采用三部附录ⅥH法检测聚山梨酯80含量，采用比色法检测十六烷基-3-甲基-溴化铵（CTAB）含量，采用三部附录ⅥB第二法检测总蛋白含量，采用酶联免疫法检测卵清蛋白含量，采用三部附录ⅫF法检查异常毒性，采用三部附录ⅫE法检测细菌内毒素含量，通过动物实验检查疫苗的安全性和免疫原性，并将疫苗放置37℃、20～25℃、2～8℃考察疫苗的稳定性。实验结果表明通过使用300目滤布过滤后，再经连续流低速离心机8000rpm离心去除大分子物质，澄清效果好，且操作较简单、速度快，可保证生产的连续性，减少污染机会，并有利于控制制品中的热原质。各批病毒尿囊液浓缩后经蔗糖密度梯度离心总蛋白去除率及病毒收获率结果均较理想。病毒在3天内既可达到灭活效果。病毒液经100KD超滤膜洗滤后，甲醛检测结果均小于25μg/ml，蔗糖糖度均小于1%，去除效果较为理想。病毒裂解后电镜下可见明显的病毒亚单位结构，未见完整病毒颗粒，裂解效果较好。流感病毒经裂解再纯化后，单价病毒原液血凝素含量较高，总蛋白和卵清蛋白含量均较低，Tween-80和CTAB绝大部分均已去除，各批单价病毒原液电泳条带纯度较高。疫苗检测结果证明抗原组分与特异性无误，HA含量完全符合国家标准，其非有效成分：甲醛、卵清蛋白、总蛋白、Tween-80及CTAB均符合药典要求，细菌内毒素含量符合药典要求，三批疫苗免疫效果良好，各批疫苗均能获得较高的中和抗体效价，动物实验结果证明疫苗是安全的，疫苗稳定性结果表明本研究研制的流感病毒亚单位疫苗具有较好的稳定性，最终我们通过用统计学方法分析确定了产品的质量标准。综上所述，本研究确定了甲型H1N1流感病毒亚单位疫苗生产制备工艺，并通过质量研究最终确定了产品质量标准，产品检测结果均符合国家标准要求，制备出了合格的第三代流感疫苗产品，疫苗成品仅保留可使人体产生保护性抗体的HA和NA抗原，极大的降低了对人体的副反应，保证了疫苗的安全性，可以作为当前预防甲流的首选疫苗。