六倍体小麦MAPKKK基因TaEDR1的克隆及功能分析

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小麦白粉病由禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis forma specialis tritici,Bgt)引起,能够造成小麦大量减产。不断发掘新的抗病基因培育抗病品种,对小麦的稳产十分重要。已有研究表明,EDR1在拟南芥抗白粉病和水稻抗白叶枯病的过程中均起到重要的调控作用,然而EDR1在普通小麦中是否存在、存在几个拷贝、在小麦对白粉菌的抗病反应中是否起作用等问题,目前尚不明确。本研究以六倍体小麦(Triticum aestivum)为材料,采用分子生物学、遗传学和生物化学方法对小麦EDR1基因(TaEDR1)进行克隆和功能分析,研究结果将为小麦抗病品种的选育提供理论基础和新的种质资源。  首先,我们通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术和同源克隆等方法,在六倍体小麦品种科农199中获得TaEDR1基因的三个拷贝,经过测序发现它们序列同源性非常高。在不同物种间进行比对,得知TaEDR1与大麦EDR1(HvEDR1)同源性最高。不同小麦品种间、二倍体小麦与六倍体小麦间的序列比对发现,TaEDR1在漫长的进化过程中一直非常保守,其中TaEDR1-1A的保守性极强,TaEDR1-1B和TaEDR1-1D次之。使用中国春缺体四体系,利用TaEDR1基因第二个外显子的长度多态性,将三个拷贝定位于小麦1A、1B和1D染色体上。利用基因枪介导的单细胞瞬时表达技术结合激光共聚焦显微镜观察,我们发现TaEDR1定位于细胞膜、细胞质和细胞核上;在过表达TaEDR1的叶片表面接种白粉菌16小时后,能够观察到TaEDR1聚集在侵染点周围。  通过VIGS(virus-induced gene silencing)和RNAi(RNA interference)技术,将科农199中的内源TaEDR1沉默,造成其表达量下调之后,检测植株对于小麦白粉菌E09的抗性,发现TaEDR1的沉默能够抑制叶片表面白粉菌菌丝发育和孢子成熟,增强小麦对白粉菌的抗性。在RNAi植株中,这种抗性能够遗传给后代。由于TaEDR1三个拷贝编码区序列高度同源,使用VIGS或者RNAi技术并不能将它们单独沉默以区分各自的功能。采用目前最具潜力的基因工程技术CRISPR/Cas9系统,针对TaEDR1基因组第四个外显子上高度同源的一段序列设计sgRNA,对科农199中的内源TaEDR1进行基因编辑,获得将三个拷贝完全敲除的阳性植株,表现出对白粉菌增强的抗性。  本研究克隆了普通小麦的TaEDR1基因,发现该基因的三个拷贝在不同品种、不同物种间序列同源性很高,暗示其功能保守。TaEDR1经基因沉默或基因敲除后,小麦表现对白粉病增强的抗病性,表明TaEDR1在小麦对白粉菌的抗病反应中具有负调控作用。此外,以基因编辑技术为工具对小麦进行改良能够应用于作物精确分子育种,本研究所获得的TaEDR1基因被敲除的CRISPR/Cas9突变体植株不带有筛选标记基因,能够稳定遗传,可以为小麦的分子育种提供理论基础和种质资源。
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