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猪链球菌(Streptococcus suis,S)是重要的人畜共患病病原,可引发猪的脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症甚至急性死亡。根据荚膜多糖抗原性的差异,猪链球菌目前分为33个血清型,其中2型(SS2)流行最广、致病力最强。近年来,猪链球菌9型(SS9)在中国和部分欧洲国家也较为流行,且在泰国已出现人感染SS9的报道。目前已经发现超过80种猪链球菌毒力因子,它们对细菌感染宿主并引发疾病至关重要。除了表面蛋白外,细菌非编码小RNA(smallRNA,sRNA)也是不可忽视的毒力因子,它们通过调控毒力基因的表达从而影响细菌毒力。本研究通过探究DNA核酸酶在SS9致病中的作用及鉴定猪链球菌2个毒力相关sRNA(rss04和rss06)的靶位,为进一步研究猪链球菌的致病机理奠定了基础。1.DNA核酸酶与猪链球菌9型毒力的关系前期研究发现,DNA核酸酶(SsnA)存在于SS9毒力株中,且位于细菌表面,但在SS9无毒株中不存在。为深入研究SsnA的生物学功能,本研究利用穿梭质粒pSET-4s构建了ssn 缺失株△ssnA,并通过斑马鱼毒力试验、HEp-2细胞黏附、猪全血存活和酶活检测等试验,评价SsnA对SS9毒力的影响。结果显示,△ssnA对斑马鱼毒力显著降低,半数致死量是野生株的11.2倍;△ssnA对HEp-2细胞的黏附率为野生株的60.61%;△ssnA在猪全血中的存活率为野生株的71.88%;酶活试验表明,SsnA可降解线性和环状DNA。该基因缺失后细菌对斑马鱼毒力、黏附HEp-2细胞能力、在猪全血中存活及分解DNA能力都显著降低,证实SsnA是SS9的一个毒力因子。2.猪链球菌小RNA靶位鉴定sRNAs靶位的鉴定对于揭示sRNA的调控机制至关重要,相关研究在革兰阳性菌中很少。前期研究发现,在SS2脑膜炎参考菌株P1/7中存在29个sRNA,其中rss04和rss06与猪链球菌毒力相关,基因缺失后细菌毒力显著降低。本研究通过构建表达融合 sRNA(MS2-rss04 与 MS2-rss06)的质粒 pAT18-MS2-rss04 和 pAT18-MS2-rss06,采用MS2识别序列纯化技术,并结合生物信息学等方法,分别鉴定出rss04候选靶位11个、rss06候选靶位15个。以rss06候选靶位SSU0057为例,通过Flag标签蛋白融合表达与免疫转印技术,发现rss06可显著抑制SSU0057蛋白表达,证实SSU0057是rss06直接靶位。上述研究为深入研究猪链球菌sRNA调控机制提供参考。