革兰氏阴性植物病原细菌产生的harpin蛋白质在植物上可以引起多种效应,包括抗病、抗虫、抗旱,促进植物生长等。作为一种多功能激发子,它非常有利于研究植物在生长发育、抗病防卫、抗虫和抗逆等过程中的相关信号传导机制。于是,harpin如何被植物识别,如何引发各种效应,并且这些反应中有哪些信号通路参与,以及harpin如何实现这些功能等多个问题成为了研究的重点。本研究着重剖析harpin促进植物生长、诱导抗病和抗虫的信号传导机制以及转录调控机制。一、水稻细菌性条斑病菌harpin蛋白HpaGXooc诱导植物抗病和促进植物生长的功能片段鉴定Harpin是由植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子,可以激发非寄主植物产生过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD),诱导植物产生防卫反应,促进植物生长。其中,后两种效应对植物有益,并且可能是通过蛋白质不同的功能域实现的。本研究分离鉴定和检测了来自于水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的一个137个氨基酸的harpin蛋白HpaGXooc的九个功能片段,产生的蛋白质分别施用于烟草(Nicotiana tabaccum)和水稻(Oryza sativa)能产生不同的效应。相比较HpaGXooc全长蛋白,HpaG10-42诱导水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)产生抗性能力最强；HpaG1-94促进水稻生长能力最强；而HpaG62-137诱导过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)能力最强。同时,HpaG62-137诱导HCD标志基因效果强于HpaGXooc全长蛋白质,HpaG10-42对水稻防卫反应基因和生长相关基因的诱导活性明显强于HpaGXooc。由此可以解释我们所观察到的蛋白质有益效应。二、HpaGXooc小分子功能片段HpaG10-42诱导水稻抗病性和提高稻米产量在第一章的研究中,产生的功能片段HpaG10-42,相比较HpaGXooc全长蛋白,在烟草上不诱导明显的细胞死亡,能促进水稻更快的生长,同时能诱导水稻对白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)产生较理想的抗性。本研究将HpaG10-42应用在水稻田间,研究HpaG10-42对水稻稻瘟病和水稻白叶枯病的控制效果以及对产量的影响。结果显示：在水稻苗期、返青期、分蘖后期、始穗期连续使用四次,同对照处理相比,6,6,6,6μg/ml的HpaG10-42使水稻白叶枯病(X.oryzae pv. oryzae)和穗颈瘟(Magnaporthe grisea)的病情指数均显著降低,并使产量明显提高,而且效果好于高浓度的HpaGXooc;在水稻四个生长时期仅用6μg/ml HpaG10-42处理一次,也可诱导水稻该生长时期的抗病性,但不如连续多次使用效果好；经过比较,HpaG10-42与化学农药的使用效果相当；在9个测试水稻品种上均能诱导抗病性和增加产量,但在不同水稻品种之间存在差异；在田间大面积示范实验中HpaG10-42效果稳定。三、HrpNEa诱导蚜虫趋避和抑制取食需要EIN2介导的韧皮部防卫反应HrpNEa是由梨火疫病菌(Erwinia amylovora)产生的harpin激发子。本实验室发现HrpNEa诱导拟南芥抑制蚜虫的繁殖需要乙烯信号通路重要因子EIN2,但是没有研究蚜虫趋避情况,同时也没有明确蚜虫取食与蚜虫趋避的关系。本研究结果表明,HrpNEa诱导蚜虫趋避。用罗丹明B标记、EPG(Electrical Penetration Graph)技术监测蚜虫的取食情况,结果表明HrpNEa抑制蚜虫的取食活动,同趋避效应有关。HrpNEa处理后,植物乙烯含量升高,并且乙烯生物合成抑制剂部分抑制HrpNEa的作用。在乙烯信号通路突变体ein5-1中,HrpNEa能够象在Col-0中一样诱导趋避效应,但在ein2-1中不能。表明HrpNEa诱导趋避效应需要EIN2。原位杂交结果表明,HrpNEa处理后可以诱导韧皮部相关蛋白基因AtPP2在韧皮部的表达,与韧皮部防卫反应(plant phloem-related defense, PRD)的作用模式一致,而PRD在防卫刺吸式昆虫取食中起作用。RT-PCR结果显示,HrpNEa可以诱导AtPP2在野生型拟南芥Col-O中的表达,但是在ein2-1突变体中不能。韧皮部相关蛋白在韧皮部的表达通常伴随有胼胝质的沉积,化学发光实验结果证明,HrpNEa同样可以诱导胼胝质在Col-0中的沉积,但是在ein2-1突变体中不能。因此,本研究结果表明HrpNEa诱导抗虫趋避效应、激发PRD反应,且ET信号传导因子EIN2参与了该过程。四、参与HrpNEa诱导拟南芥抗虫作用转录因子的筛选通过RT-PCR方法对拟南芥Col-O中受HrpNEa诱导的转录因子进行筛选。在研究的37个转录因子中,初步筛选到21个受HrpNEa诱导上调的转录因子,随机选取13个基因用Northern方法验证,其中有12个基因被诱导表达上调。Realtime RT-PCR进一步筛选的结果显示,AtMYB51,AtMYB38,AtMYB108, AtMYB30, AtMYB44, AtERF11, RAP2.12, F15H21.12和AtHB-7被不同程度的诱导表达,AtMYB44被诱导的效果最为明显。同时对37个突变体中蚜虫趋避以及蚜虫繁殖情况进行了研究。结果表明,在atmyb44突变体中,HrpNEa诱导后趋避率最小,对蚜虫繁殖情况没有明显影响。因此,HrpNEa诱导抗虫的效果在atmyb44突变体中被严重阻断。通过转录因子基因被HrpNEa诱导的情况,结合处理后突变体中HrpNEa诱导抗虫效果两方面的实验结果,筛选到一个感兴趣的转录因子AtMYB44,参与调控HrpNEa诱导的拟南芥抗虫性。五、AtMYB44通过作用于乙烯信号传导因子EIN2调控拟南芥对桃蚜的诱导抗性AtMYB44是拟南芥的一种转录因子,可以对乙烯发生感应,从而介入植物防卫反应。植物防卫反应经常受乙烯信号传导支配,而乙烯信号需要EIN2作为中心调控因子才能完成传导。我们以前研究表明EIN2在HrpNEa诱导拟南芥对蚜虫产生防卫反应的过程中起关键作用,但AtMYB44调控的靶标及EIN2的转录调控机理都还不清楚。在HrpNEa处理Col-0后,植物乙烯含量升高,蚜虫趋避且蚜虫繁殖受到抑制。但是在atmyb44突变体中,HrpNEa虽然能够诱导乙烯含量升高,但是不能诱导蚜虫趋避效应和抑制蚜虫繁殖。外源乙烯作用与HrpNEa作用效果相同。遗传学及药理学实验研究表明,乙烯和AtMYB44对于HrpNEa诱导拟南芥抗虫互为必需。在Col-0中,EIN2能够被诱导表达,但是在atmyb44突变体中不能,在回补实验材料中EIN2的表达情况与在Col-0中类似。因此,EIN2诱导表达需要AtMYB44。将AtMYB44原核表达并部分纯化用于GMSA实验,结果表明AtMYB44能与EIN2的启动子序列体外特异性结合。用atmyb44得到遗传互补的转基因植物Mgh/m提取核蛋白用于GMSA实验,结果表明AtMYB44与EIN2启动子发生特异结合。用HrpNEa处理Col-0和Mgh/m植株,既促进了AtMYB44蛋白的产生,也提高了AtMYB44与EIN2互作的能力,还增强了EIN2的表达水平。Col-0和Mgh/m植株不受HrpNEa诱导的条件下,人工定殖的蚜虫可以诱导这两类植物表达AtMYB44和EIN2基因,同时诱导这两类植物对第二次定殖的蚜虫产生抗蚜性反应,而基因表达与抗虫反应在atmyb44体内均不能被蚜虫所诱导。这些试验结果表明,AtMYB44通过启动EIN2的表达来控制拟南芥对蚜虫的抗性。这一调控过程无论对诱导抗性还是免疫反应均显示功能,代表了植物抵抗植食性昆虫的一种重要防卫机制。六、创新点1.实验阐述了水稻细条斑病菌产生的harpin蛋白HpaGXooc不同结构域与功能的关系。挑选出来的三个片段HpaG1-94、HpaG10-42、HpaG62-137分别在促进植物生长、诱导抗病和诱导过敏性细胞死亡方面表现最为突出。其中,HpaG10-42促进植物生长、诱导植物抗病性,但是不诱导肉眼可见的过敏性细胞死亡,为高效重组表达HpaGXooc蛋白提供理论基础。将HpaG10-42应用在水稻田间,效果好于全长片段HpaGXooc,且与化学农药效果相当,能够诱导抗病性,并最终使稻米产量增加。2.研究明确EIN2介导植物韧皮部防卫反应,并在HrpNEa诱导拟南芥对桃蚜的抗性发生过程中起重要作用。3.对HrpNEa诱导的转录因子进行筛选鉴定,结果证明AtMYB44在HrpNEa诱导拟南芥抵抗桃蚜的过程中起重要作用,进一步实验表明,AtMYB44通过启动EIN2的表达来控制拟南芥对蚜虫的抗性。