胶质瘤(glioma)是颅内最常见的一种原发性神经系统恶性肿瘤,约占颅内肿瘤的46%,占全身恶性肿瘤的1%到3%。世界卫生组织(WHO)根据肿瘤细胞的密度、瘤细胞的多形性或非典型性、瘤细胞核的高度异型性、核分裂活性、血管增生、坏死、增值指数等7项指标,将胶质瘤在病理上分为4级,I-II级为低级别胶质瘤,III-IV级为高级别胶质瘤。IV级的胶质瘤也称为胶质母细胞瘤或者多形性胶质母细胞瘤,在病理上常特征性表现为组织缺血性坏死,强浸润性及微血管增殖。随着分子生物学技术的不断进步,目前认为脑胶质瘤细胞主要来源于神经元周围发生恶变的胶质细胞,星形细胞或少突胶质细胞等,其具有高度异质性的特点。现有的经典病理学往往忽视了胶质瘤的高度异质性,难以满足精准治疗的要求。2016年脑胶质瘤的WHO分类引入了基因型,将胶质瘤分为许多亚类,如IDH1突变型和野生型弥漫性胶质瘤。同时强调了分子事件在胶质瘤中的重要性,如ATRX和TP53突变多发生在星形胶质细胞瘤,1p/19q共缺失多见于少突胶质细胞瘤等。虽然经典组织病理学结合基因的分子分型为胶质瘤患者带来了新的诊断和治疗策略,但是胶质细胞瘤的治疗效果仍不令人满意。胶质母细胞瘤患者采用手术切除,联合术后放疗及替莫唑胺(TMZ)化疗,五年生存率仅为9.8%,中位生存期仅为14.6个月。目前国际上对于原发或者复发胶质母细胞仍没有一个有效临床治疗方法。胶质瘤特别是高级别胶质瘤的治疗是目前国际上神经外科的难点和挑战之一。近年来,分子靶向治疗正成为恶性肿瘤治疗的一个新方法,这或许为神经胶质瘤的治疗提供了一个可能的途径。因此,寻找神经胶质瘤发生、发展及浸润等过程中重要的分子正成为目前神经外科专业的研究热点和方向之一,以期为胶质瘤的诊断及治疗寻找可能的靶点。SSFA2(精子特异性抗原2),也称为KRAS诱导肌动蛋白相互作用蛋白(KRAP)。人KRAP基因最初被鉴定为在人结肠癌HCT116细胞中被激活的KRAS上调表达水平的基因之一,被认为是大肠癌中解除调控的基因之一。KRAP基因编码一种与丝状肌动蛋白(f-actin)相关的细胞质蛋白,氨基酸序列在从鱼类到哺乳动物的KRAP直系亲属中均高度保守。目前研究发现缺乏KRAP的小鼠表现出全身能量代谢的改变和对饮食引起的肥胖和糖尿病的抵抗。尽管KRAP缺陷小鼠代谢表型的确切机制尚不清楚,KRAP还是被认为是代谢相关疾病的目标。近年来,越来越多的研究表明SSFA2可能成为癌症的潜在靶点。在小细胞肺癌中SSFA2与癌细胞的肝脏优先转移有关;在淋巴瘤中实验P38-MAPK信号通路抑制剂可以下调SSFA2在淋巴瘤细胞中的表达,有效抑制恶性淋巴瘤的进展;在慢性淋巴细胞白血病SSFA2的表达可能与癌细胞的增殖表型相关等。这些研究均表明SSFA2与癌症的恶性进展密切相关。然而,SSFA2基因在胶质瘤发生发展中所发挥的作用目前尚不清楚。在本研究中我们将SSFA2作为胶质瘤的一个潜在靶点,研究其在胶质瘤恶性进展中所发挥的作用及分子机制,为胶质瘤的诊断和治疗提供一个新的靶点。第一部分SSFA2在人脑胶质瘤及胶质瘤细胞中的表达目的:明确SSFA2基因在人脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞中的表达情况,为我们进一步研究SSFA2在恶性胶质瘤细胞中的生物学功能奠定实验基础。方法:(1)通过分析常用肿瘤数据库(TCGA,CGGA,REMBRANDT)中SSFA2基因在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况。(2)采用实时定量PCR方法检测30例手术收集的人脑胶质瘤组织标本(较低级别18例:WHO II-III级,胶质母细胞瘤12例)及6例外伤手术中废弃的正常脑组织标本中SSFA2的m RNA的表达水平。(3)采用实时定量PCR方法,检测人源的4株胶质瘤细胞株U251、U87、U373、A172细胞中SSFA2基因m RNA水平的表达丰度。结果:(1)TCGA、REMBRANDT数据库中SSFA2的表达在胶质瘤组织中相较于正常脑组织明显升高(p<0.01);CGGA数据库中显示SSFA2的表达随胶质瘤级别的升高不断升高(p<0.01)。(2)定量PCR结果显示与正常脑组织相比,胶质瘤组织中SSFA2的表达明显升高(p<0.01)。(3)实时定量PCR方法检测SSFA2在胶质瘤细胞U251、U87、U373、A172四株胶质瘤细胞株中的表达丰度,结果显示在胶质瘤细胞系中SSFA2基因均具有很高的表达丰度。结论:SSFA2基因在胶质瘤组织中的表达明显升高,且在胶质瘤细胞株中具有很高的表达丰度。为下一步继续研究SSFA2在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定了基础。第二部分下调SSFA2对胶质瘤细胞增殖、周期及凋亡的影响(体外试验)目的:体外研究SSFA2对于胶质瘤细胞株U87及U251的增殖、细胞周期及凋亡的影响,初步阐明SSFA2基因在胶质瘤细胞株U87及U251中的功能。方法:(1)设计和合成靶向SSFA2的短发夹RNA(sh RNA),同时构建慢病毒载体(LV-sh RNA-SSFA2)。(2)慢病毒转染胶质瘤细胞株,构建稳定敲低SSFA2基因的细胞株,采用实时定量PCR测定SSFA2基因在两株胶质瘤细胞的敲减效率;慢病毒转染293 T细胞,Western Blot检测干扰靶点的有效性。(3)用MTT法和Celigo细胞计数测定下调SSFA2基因的表达后,对胶质瘤细胞U251及U87细胞增殖的影响。(4)流式细胞仪分析下调SSFA2基因的表达后,对胶质瘤细胞U251及U87细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:(1)定量PCR结果显示我们设计的LV-sh RNA-SSFA2能够明显下调SSFA2基因在胶质瘤细胞中的表达;Western-blot结果显示LV-sh RNA-SSFA2能够在蛋白水平抑制SSFA2基因的表达。(2)MTT法和Celigo细胞计数结果显示,在胶质瘤细胞中下调SSFA2的表达后,胶质瘤细胞的增殖受到明显抑制(p<0.01)。(3)流式细胞检测显示在胶质瘤细胞中下调SSFA2的表达后,胶质瘤细胞的凋亡率明显增加,同时对细胞周期的分布产生影响。结论:在胶质瘤细胞中,下调SSFA2基因的表达后,胶质瘤细胞的增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加,这提示我们SSFA2基因可能在胶质瘤细胞的细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡过程中存在重要作用。第三部分下调SSFA2基因后对胶质瘤细胞致瘤能力的影响(体内实验)目的:明确在胶质瘤细胞中下调SSFA2基因后,胶质瘤细胞在裸鼠体内致瘤能力的影响。方法:建立稳定低表达SSFA2的胶质瘤细胞U87(LV-sh RNA-SSFA2 U87)及正常表达SSFA2的胶质瘤细胞U87(LV-sh RNA-Ctrl U87)。将裸鼠随机分为对照组和实验组,在各组裸鼠右侧皮腋下注射相同数量的低表达SSFA2的胶质瘤细胞U87(LV-sh RNA-SSFA2 U87)及正常表达SSFA2的胶质瘤细胞U87(LV-sh RNA-Ctrl U87)。在后续饲养过程中观察并记录皮下肿瘤的形成情况,每周2次测量皮下肿瘤瘤体体积和裸鼠重量,并在35天后处死裸鼠后瘤体称重,比较两组的差异。结果:当裸鼠饲养至第16天时,实验组裸鼠(注射LV-sh RNA-Ctrl U87细胞)皮下肿瘤体积明显低于对照组(注射LV-sh RNA-Ctrl U87细胞);同时我们发现肿瘤体积的差异趋势随着饲养时间的增加愈加明显。在处死裸鼠,对皮下肿瘤进行称重,我们发现实验组裸鼠皮下肿瘤重量明显低于对照组裸鼠皮下肿瘤重量。结论:在胶质瘤细胞中下调SSFA2基因的表达后可以明显抑制胶质瘤细胞的成瘤能力。第四部分下调SSFA2基因影响胶质瘤细胞生物学特性的分子机制研究目的:通过基因芯片初步研究SSFA2影响胶质瘤细胞生物学特性的分子机制。方法:在胶质瘤细胞U87中对SSFA2进行基因敲减,分为阴性对照组及敲减组,分别分离总RNA,使用Affymetrix全基因组表达谱芯片进行杂交,检测该基因敲减后其他基因的变化水平。对差异基因进行IPA分析和个性疾病关键基因分析,分析得到下游重要信号分子。选取显著变化的下游应答基因,通过qPCR及WESTERN BLOT检测其表达水平。结果:我们在下调SSFA2基因的胶质瘤细胞U87中获得了许多与阴性对照相比的差异基因。进一步使用IPA分析分析了基因表达谱的结果,结果表明NLRP12被预测为强激活,下游有10个基因被这个基因激活。同时IL2被预测为强烈抑制,下游有29个基因被该基因抑制。此外,基因相互作用网络图显示了一个特定功能区内分子间相互作用的网络。最后,我们使用WB检测了相关蛋白的表达。分析结果表明,IL1A蛋白下调了76%,IL1B蛋白下调了54%,CDK6蛋白明显下调。结论:靶基因SSFA2可能通过调控IL1A、IL1B、CDK6等基因调控胶质瘤的进展。