论文部分内容阅读
研究背景：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病,发病机制涉及抗原递呈细胞、T细胞、B细胞、滑膜成纤维细胞及细胞因子,在疾病发展过程中滑膜增殖形成血管翳,造成软骨和骨的侵蚀破坏,最后导致关节强直、畸形、功能丧失和不同程度的残废。树突状细胞(dendritic cell, DC)是公认的功能最强大的专职性抗原提呈细胞,在诱导免疫反应及免疫耐受形成中起重要作用。耐受性DC (tolerogenic dendritic cells, tDCs)具有诱导T细胞耐受从而抑制自身免疫反应的作用；诱导调节性T细胞(Treg)增殖和分化；分泌高剂量的IL-4、IL-10,一方面可以使Thl细胞产生IFN-a,从而抑制炎症反应,另一方面,高剂量IL-10也减少DC表面MHC-II分子、共刺激分子和黏附分子表达,不能为T细胞提供相应的刺激信号。目前仅有一些初步研究探讨了tDC在类风湿关节炎中的作用,而如何获得安全有效的耐受性DC成为研究的关键。血管活性肠肽(VIP)是潜在的免疫抑制剂,可以影响固有免疫和获得性免疫,VIP治疗胶原诱导关节炎,能减少致炎因子产生,增加抑炎因子水平,减轻关节炎症和骨侵蚀。VIP作用机理是通过与巨噬细胞、树突状细胞表面的受体(VPAC1)结合,诱导细胞钝化,而VPAC1是树突状细胞的主要功能受体,因此有研究采用VIP诱导培养tDC,发现VIP诱导培养的人类耐受性DCs可上调CD4及CD8调节性T细胞(Treg细胞),而后者可通过下调Th1细胞的活性和归巢来缓解炎症性疾病的病程,证实了VIP-tDCs的免疫耐受作用。tDC要作为治疗细胞回输体内,必须保证低或无免疫原性,然而,Heusch等研究发现作为治疗性tDC一旦进入宿主体内可能会诱导产生免疫源性而非免疫耐受,因而获得低免疫源性的tDCs成为tDC治疗的另一关键,如采用低剂量GM-CSF培养液、加入抑炎因子如IL-4、IL-10等方法。而更直接获得tDCs的方法则是通过抑制DC成熟过程中的信号传导途径来实现,其中核因子κB (NFκB)是参与其成熟的重要的核转录因子,Zanetti等在体内试验证实了NFκB在DCs成熟中的重要性,从敲除NFκB的RelB基因大鼠获得的tDCs免疫大鼠,结果显示其抗原特异性呈低反应性,说明了通过阻断NFκB途径获得tDC的可行性,并可有效降低其免疫原性反应。此外,Popov等报道应用NF-κB拮抗剂(LF15-0195)诱导培养耐受性DCs,不仅成功获得了具有未成熟DCs细胞表型的tDCs,免疫实验性关节炎大鼠也观察了初步的临床缓解,并抑制了抗原特异性T淋巴细胞反应。因此,通过干预DCs成熟过程中的不同环节及改变不同细胞因子诱导培养条件,可能获得具有低免疫原性并能诱导抗原特异性免疫耐受的tDCs,并应用于实验性关节炎的干预治疗,从而为进一步揭示RA发病机制,寻找免疫干预的不同位点和方法具有重要的意义。本研究用不同方法诱导培养tDCs,寻找合适的作为耐受性DC培养条件,同时将VIP诱导培养的具有高效免疫耐受活性的tDC与阻断NFκB途径获得的非成熟DC的低免疫源性相比较,从而获得具有免疫调节作用的高效耐受性DCs,鉴定其细胞表型、分泌的细胞因子,用获得的耐受性DC干预胶原诱导的实验性类风湿关节炎小鼠,评估治疗效果,并探讨tDC可能的作用机制。研究目的：1、探索合适的VIP、Bay11-7082诱导耐受性树突状细胞(tDCs)的体系,并鉴定诱导的耐受性树突状细胞表面分子标志、及其所分泌的细胞因子；2、验证不同诱导方法诱导的耐受性DCs进行免疫干预治疗胶原诱导类风湿关节炎的可行性与有效性；3、探讨耐受性树突状细胞治疗胶原诱导类风湿关节炎可能的作用机制。研究内容：1、耐受性树突状细胞的诱导和功能鉴定；提取DBA/1小鼠骨髓细胞,分别给予GM-CSF、IL-4、不同浓度VIP、Bay进行诱导培养,流式细胞仪检测细胞表型,ELISA检测培养上清液中TNF-α、IFN-γ、 IL-1β、IL-4浓度。结果：不同浓度VIP、Bay刺激均能使树突状细胞表面分子标志MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86表达下调,与空白组相比有统计学意义。而树突状细胞特异性表面标志CD11c在各组间表达无统计学差异。VIP浓度不同,细胞成熟表面分子标志表达下调程度不同,但各组间差异没有统计学意义,其中以VIP40ng/ml组下调最明显。Bay浓度不同,细胞成熟表面标志表达降低程度也不同,其中Bay0.5μg/ml组MHCII及CD80降低程度大于0.1μg/ml组,组间差异有统计学意义。空白DC组、VIP组、Bay组培养上清液中,TNF-α及IL-1β水平在各组无统计学差异,而IFN-γ水平在VIP-DC及Bay-DC组均较空白DC组降低(P<0.05),而IL-4水平则较空白DC组明显升高(P<0.05)。VIP40ng/ml及Bay0.5μg/ml是最适合的培养条件。2、耐受性树突状细胞治疗类风湿关节炎的疗效；采用牛Ⅱ型胶原乳剂足部注射诱导DBA/1小鼠实验性类风湿关节炎,实验性类风湿关节炎造模成功后,随机分为4组：未发病组、发病未治疗组、空白DC组、VIP-DC组、Bay-DC组,分别给予生理盐水、空白DC、VIP-DC及Bay-DC腹腔注射免疫小鼠,采用关节炎评分指数、microMRI和病理检测滑膜炎程度及骨侵蚀情况评估疗效。结果：VIP-DC及BAY-DC治疗组关节炎积分下降趋势较对照及空白DC组明显,但无统计学差异；足趾和踝关节microMRI检测,VIP-DC组及Bay-DC组CIA小鼠关节滑膜增厚程度及肿胀程度均较发病未治疗组及空白DC组有所减轻；受累关节病理学检查显示：发病未治疗组和空白DC治疗组,滑膜细胞明显增厚,细胞层数平均增加1倍,VIP-DC和Bay-DC治疗后滑膜细胞增厚有好转,但仍厚于正常关节,各组间虽有变化趋势,但统计学没有差异。炎症细胞浸润评分、炎症评分有类似变化。血管翳与骨侵蚀明显相关,发病未治疗和空白DC组血管翳增生明显,VIP-DC台疗后血管翳消失,具有统计学差异(p=0.005),Bay-DC治疗后血管翳有好转,但差异没有统计学意义。VIP-DC及Bay-DC组均较发病未治疗组及空白DC组具有较少的骨侵蚀(P=0.002,P=0.026)。与未发病组比较,其他各组滑膜细胞增殖、细胞浸润、血管翳、炎症及骨侵蚀评分增加,P<0.05,均有统计学差异。VIP-DC组与Bay-DC组比较,血管翳评分减少,P<0.05。3、耐受性树突状细胞治疗类风湿关节炎机制研究采用ELISA法检测模型鼠血清抗Ⅱ型胶原抗体及致炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β及抑炎因子IL-4浓度。结果：抗Ⅱ型胶原抗体发病未治疗组明显高于未发病组,空白DC组、VIP-DC组、Bay-DC有下降趋势,但没有统计学意义(P>0.05)。与未发病组比,发病未治疗组TNF-a明显升高,差异有统计意义,IFN-γ、IL-1β有升高趋势,IL-4浓度有降低趋势,但没有统计意义(P>0.05)。与发病未治疗组比,VIP-DC治疗后TNF-α、IL-1β浓度降低,差异有统计意义(P<0.05),Bay-DC j治疗后IFN-γ、 IL-1β明显降低,IL-4明显升高,差异有统计意义(P<0.05)。研究结论：1、VIP, Bay诱导的耐受性树突状细胞具有低表达MHCⅡ、CD40、CD80、 CD86分子,高表达CDllc特性,并高水平分泌IL-4,低水平分泌IFN-γ。2、VIP-DC及Bay-DC台疗后CIA小鼠关节炎指数下降,microMRI检测的关节炎症程度、滑膜增厚、关节肿胀减轻；病理显示VIP-DC及Bay-DC治疗后骨侵蚀减轻,VIP-DC治疗血管翳评分明显减低。3、VIP-DC及Bay-DC的作用机制可能通过减少抗Ⅱ型胶原抗体的产生,抑制促炎因子产生、增加抑炎因子产生而减轻关节炎症、减轻滑膜炎和骨侵蚀。