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研究目的通过设计制作确定性侧向位移（Deterministic lateral displacement，DLD）微流控芯片，实现循环肿瘤细胞快速、高回收率分选富集，建立一种基于细胞尺寸特性的可快速分选富集循环肿瘤细胞的新型方法。研究方法1.微流控芯片设计：参照文献及本研究团队之前的研究，设计圆形、三角形两种微柱的DLD微流控芯片，根据文献方法确定了芯片的尺寸，微柱间隙及微柱直径等参数。2.芯片的制作：按照设计的图形制作掩膜，取干净硅片经氧等离子清洗后，旋涂SU8-3025光刻胶制作模板，使用三甲基氯硅烷进行硅烷化处理。选择聚二甲基硅氧烷（PDMS）与固化剂按照不同比例混匀除泡，倒入模板中抽真空除泡放入烤箱80℃烘烤1h，取出后按芯片设计大小切割打孔。取硫酸双氧水预清洗好的玻片，氮气吹干净，与切割好的PDMS一并进行氧等离子清洗，键合，置80℃烤箱烘烤30分钟，对比不同PDMS固化剂比例的芯片结果，选取合适比例的芯片备用。3．肿瘤细胞悬液分选富集实验：培养细胞尺寸不同的5种肿瘤细胞：人乳腺癌细胞（MDAMB231cells）、人乳腺癌细胞（MCF-7cells）、人肺癌细胞（A549cells）、人肝癌细胞（HEPG2cells）、人食管鳞状细胞癌细胞（KYSE150cells）做为圆形微柱DLD阵列微流控芯片内肿瘤细胞悬液分选富集实验对象，选取尺寸最大及尺寸最小的肿瘤细胞做为三角形微柱DLD阵列微流控芯片内肿瘤细胞悬液分选富集实验对象，对肿瘤细胞进行荧光染色，用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline,PBS）配制成浓度为105/ml的肿瘤细胞悬液，使用注射泵按照流速30、50、100、500、1000、2000（μL/min）从芯片入口通入肿瘤细胞悬液，使用具有高速摄像功能的荧光显微镜进行观察并拍摄视频，收集芯片三个出口的肿瘤细胞悬液，分别计算中央富集出口的肿瘤细胞浓度（C1）及溶液体积（V1），两侧非富集出口的肿瘤细胞浓度（C2）及溶液体积（V2）通过以下公式计算出回收率。回收率=C1V1/（C1V1+C2V2）4．模拟外周血循环肿瘤细胞分选富集实验：通过对比两种微柱DLD阵列微流控芯片回收率，选取分选富集效果较好的DLD阵列微流控芯片做为研究模拟外周血循环肿瘤细胞分选富集实验的芯片，以MCF-7肿瘤细胞做为研究对象。为了更好的区分观察肿瘤细胞与血细胞，对肿瘤细胞进行荧光染色。正常志愿者EDTA抗凝血，使用生理盐水进行10倍稀释。荧光染色后的肿瘤细胞与已稀释好的血样本中配制成浓度为104/ml的模拟外周血循环肿瘤细胞悬液，按照肿瘤细胞悬液分选富集实验的方法通入芯片进行分选富集并计算回收率。5.使用Gambit软件及Ansys软件分析探讨微柱形状、流速、细胞大小对回收率的影响关系。研究结果1.微流控芯片效果的评价：对芯片的制作各个步骤进行优化，制作完成两种微柱DLD微流控芯片，通入肿瘤细胞悬液，显微镜观察并拍摄视频，可见肿瘤细胞在入口处呈现随机进样，通过DLD阵列可见肿瘤细胞向中间富集通道汇聚，在中间富集通道出口处可见较多的肿瘤细胞，通道两侧未见肿瘤细胞。证明芯片具有分选富集效果。2.肿瘤细胞悬液的分选富集实验结果：圆形微柱DLD阵列微流控芯片中，在流速为30μL/min时，MCF-7和KYSE150肿瘤细胞回收率为99%及98%，MDAMB231、A549及HEPG2肿瘤细胞回收率约90%。流速100μL/min时，MCF-7和KYSE150肿瘤细胞的回收率50%，MDAMB231、A549及HEPG2肿瘤细胞回收率40%。当流速1000μL/min时，5种肿瘤细胞其回收率均小于20%。当流速2000μL/min时，5种肿瘤细胞回收率约15%。基于圆形微柱DLD微流控芯片的研究，证明大尺寸细胞较小尺寸细胞具有更好的分选富集效果，因此选择MCF-7肿瘤细胞及MDAMB231肿瘤细胞进行三角形微柱DLD阵列微流控芯片分选富集实验，在流速为30μL/min时，MCF-7肿瘤细胞回收率高达100%，MDAMB231肿瘤细胞为99%。流速100μL/min时，MCF-7肿瘤细胞回收率高达97%，MDAMB231肿瘤细胞为95%。流速高达1000μL/min时，MCF-7肿瘤细胞回收率未见明显的降低，MDAMB231肿瘤细胞降低为70%，流速高达2000μL/min时，MCF-7肿瘤细胞回收率95%，MDAMB231肿瘤细胞降低为64%。3.模拟外周血循环肿瘤细胞的分选富集实验结果：三角形DLD微流控芯片进行模拟外周血循环循环肿瘤细胞分选富集实验，速度在50μL/min时，两侧非富集出口未见肿瘤细胞，回收率仍然高达100%，速度增加到2000μL/min时，两侧非富集出口肿瘤细胞数量增多，回收率仍高达95%。4.微柱形状、流速、细胞大小对回收率的影响关系的结果：细胞的变形会使得细胞的有效半径减低，当有效半径低于DLD阵列的分选临界半径的时候，细胞将不会出现侧向位移。三角形微柱DLD阵列与细胞碰撞为一个点，圆形微柱DLD阵列与细胞碰撞为一个面，因此细胞变形更大。流体流速更大流体剪切力更大，细胞变形更大。大细胞即使发生变形其有效半径仍然可能大于DLD阵列分选临界半径。结论1.三角形微柱DLD阵列微流控芯片的分选富集效果优于圆形微柱DLD阵列微流控芯片。2.采用三角形微柱DLD阵列微流控芯片可实现快速、高回收率的外周血循环肿瘤细胞的分选富集。3.细胞变形可解释微柱形状、流速、细胞大小对回收率的影响关系，为以后的芯片设计研究提供了一个依据。4.模拟外周血循环肿瘤细胞浓度远高于实际肿瘤病人外周血循环肿瘤细胞浓度，分选后的肿瘤细胞中存在血细胞，未结合基于抗原抗体特性特异性肿瘤细胞的分选检测，以上的不足与难点本课题组将进一步研究。