一、研究背景:　　 癫痫是由脑神经元异常过度放电引起的、以反复发作神经系统功能异常为特征的慢性脑部疾患。癫痫为一种常见病,国内流行病学调查显示其患病率为7‰,全国约有600万～700万病人,见于各个年龄组,青少年和老年是癫痫发病的两个高峰年龄段。使用卡马西平(Carbamazepine,CBZ)和苯巴比妥((Phenobarbital,PB)等抗癫痫药物(antiepileptic drugs,AEDs)治疗可以控制或减少多数患者的癫痫发作。但仍有约30％的患者虽经多种抗癫痫药物治疗仍难以控制发作,发展成为难治性癫痫(refractory epilepsy)。　　 而通常如果患者对一种AED耐受,往往也对其他的AEDs也不敏感。人们推测存在一种共同的机制影响抗癫痫药物的作用。目前研究认为,P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)可能参与了癫痫耐药的机制。现在国内外相关研究也已证实,很多AEDs均为上述两种耐药蛋白的底物,而且P-gp和LRP在难治性癫痫患者脑组织内呈过表达。　　 但是由于病例标本的相对匮乏,国内外针对患者手术切除脑组织进行的研究很少,大部分研究仍以实验动物为主要对象。有关难治性癫痫患者脑组织病灶区域和灶旁区域耐药蛋白表达情况和AEDs浓度的比较研究,以及耐药蛋白表达量与AEDs浓度的相关性分析尤为缺乏。而我们认为,这可能会从一个新的角度阐释难治性癫痫耐药的机制。　　 二、研究目的:　　 通过对难治性癫痫患者脑组织中病灶区域和灶旁区域中P-gp、LRP表达量和CBZ、PB药物浓度的比较及相关性研究,进一步探讨难治性癫痫耐药的机制,从而为癫痫患者的临床合理用药提供理论依据。　　 三、研究方法:　　 1.实验对象的选取及分组方法:　　 选取32例难治性癫痫患者手术切除脑组织标本作为病例组,病理论断包括FCDIA1例、FCDIB15例、FCDⅡA4例、FCDⅡ B2例、难治性癫痫相关脑肿瘤10例,包括GG 6例,DNT4例。根据患者用药情况及病理论断将这些病例分为以下6个研究组:①CⅠF组:服用CBZ的FCDⅠ型患者脑组织病灶区域,共10例；②CⅡF组:服用CBZ的FCDⅡ型患者脑组织病灶区域,共6例；③cⅡA组:服用CBZ的FCDⅡ型患者脑组织灶旁区域,共6例；④CF组:服用CBZ的癫痫相关脑肿瘤患者脑组织病灶区域,共10例；⑤CⅢA组:服用CBZ的癫痫相关脑肿瘤患者脑组织灶旁区域,共10例；⑥PⅠF组:服用PB的FCDⅠ型患者脑组织病灶区域,共6例。　　 2.实验方法:　　 (1)部分脑组织标本经20％PBF固定后进行包埋切片,应用Envision二步法进行免疫组织化学标记,观察P-gp、LRP在FCD和难治性癫痫相关脑肿瘤脑组织中的表达部位和表达强度。　　 (2)另有部分脑组织标本经-80℃低温冰箱冻存后进行匀浆、离心,取上清。部分上清应用Western-Blot法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,经ECL法显影后,得到P-gp、LRP待测蛋白条带,应用ImageJ 1.41o图像分析系统对所得结果进行分析,从而得到待测蛋白定量测量结果。　　 (3)另取离心后剩余上清应用FPIA法,放入TDx仪测试池内,仪器自行取样、稀释、加试剂、保温、测定、计算及打印脑组织CBZ、PB浓度结果。　　 3.数据统计分析:　　 按照前述分组方法应用SPSS 16.0统计分析软件对各组测量值进行统计学分析比较。对于每一组符合正态分布的资料用均数±标准差来表示其平均水平。选择运用秩和检验(Rank Sum Test)和配对T检验(Paired-samples T Text)进行总体和/或组间比较分析,运用配对x2检验(Chi-square Test)和Spearman等级相关检验(Spearmans Rank Correlation)进行耐药蛋白含量和AEDs浓度相关性的比较分析,以P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异具有高度统计学意义。　　 四、实验结果:　　 1.一般情况:32例难治性癫痫患者,平均发病年龄10.3±8.7岁；平均手术年龄21.44-10.1岁；平均病程11.1±7.4年,其中19例男性,13例女性。　　 2.耐药蛋白的表达情况:P-gp在FCD主要表达于脑组织内的毛细血管内皮细胞,部分神经元成分也有阳性表达。P-gp在难治性癫痫相关脑肿瘤组织中,肿瘤细胞呈阴性,但是病灶区域的毛细血管内皮呈强阳性表达。　　 LRP与P-gp不同的是,在FCDⅡA型病例病灶区域的形态异常神经元为阴性；而在FCDⅡB型病例病灶区域的气球细胞和神经毡结构中,其呈现强阳性表达。LRP在难治性癫痫相关脑肿瘤中,除病灶区域毛细血管内皮呈强阳性外,部分肿瘤性胶质细胞及少量神经节样细胞呈中度阳性表达。　　 3.耐药蛋白的定量结果:P-gp印在不同组别病灶区域脑组织中表达量的差异具有高度统计学意义(P<0.01)；P-gp在同一组别脑组织中,病灶区域的表达量与灶旁区域差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　 LRP在不同组别病灶区域脑组织中表达量的差异具有高度统计学意义(P<0.01)；LRP在同一组别脑组织中,病灶区域的表达量与灶旁区域差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 4.AEDs浓度结果:CBZ在FCDⅡ型病例病灶区域浓度与灶旁区域差异无统计学意义(P>0.05)；在难治性癫痫相关脑肿瘤病灶区域浓度与灶旁区域差异具有统计学意义(P<0.05)。　　 5.相关性分析:在9例病灶区域CBZ浓度低于灶旁区域的标本中,8例标本内病灶区域P-gp、LRP同时升高。P-gp、LRP表达量与难治性癫痫患者脑组织CBZ、PB浓度等级相关关系分析无统计学意义(P>0.05)。　　 五、结论:　　 1.P-gp和LRP两种耐药蛋白在FCD和难治性癫痫相关脑肿瘤患者脑组织中均存在表达,但表达部位不同。P-gp和LRP在FCDⅡ型和难治性癫痫相关脑肿瘤病例的病灶区域表达高于灶旁区域,其表达差异具有统计学意义。进一步证实了两种耐药蛋白在参与耐药过程中具有不同的作用机制。　　 2.CBZ在难治性癫痫相关脑肿瘤病例的病灶区域浓度低于灶旁区域,其浓度具有差异具有统计学意义。间接地证实了耐药蛋白参与难治性癫痫耐药的过程。而CBZ在FCDⅡ型病例组病灶区域和灶旁区域浓度无明显差异。我们推测在FCDⅡ型和脑肿瘤中AEDs参与耐药的机制亦不尽相同。　　 3.在难治性癫痫相关脑肿瘤病例中病灶区域与灶旁区域比较,P-gp和LRP耐药蛋白表达量升高的同时CBZ浓度降低。但是P-gp和LRP表达量与CBZ浓度不存在等级相关关系。推测癫痫的耐药是一个复杂的过程,可能有不同的机制参与了耐药过程。