一、研究的背景及意义苯胺类聚合物是一类最早合成的导电聚合物,Fritzsche早在1840年就报道了聚苯胺（PANI）的合成。苯胺类聚合物可采用化学合成法,也可采用酶催化法合成。化学合成法主要包括,化学氧化聚合、电化学聚合、乳液聚合、反向微乳液聚合、缩合聚合和模板聚合等。酶催化合成法主要采用过氧化物酶催化合成聚苯胺。采用不同的聚合方法得到了导电性、溶解性等性能不同的聚苯胺。酶催化合成只需常温常压和温和的反应条件,催化效率高,对底物和产物的立体专一性强,副反应少,产物易于分离纯化。酶催化反应代替化学合成反应可以简化工艺、节省设备、无传统工艺的危险性和减少环境污染等。近年来,酶催化化学反应越来越受到人们的广泛关注。目前,可用于酶催化法合成苯胺类聚合物的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、漆酶、大豆过氧化物酶等。其中,HRP已被最为广泛地应用于酶催化化学反应。可以预期,HRP在催化氧化合成聚苯胺类化合物方面具有潜在的应用前景,利用HRP催化氧化苯胺类化合物发生聚合反应是合成聚苯胺类化合物的极具魅力的选择。HRP可以催化氧化苯胺类化合物,并可在水相或非水相溶剂中催化苯胺类化合物发生聚合反应,合成聚苯胺类化合物,HRP催化苯胺类单体聚合反应是在H₂O₂作为氧化性底物存在下进行的。然而,令人遗憾的是:H₂O₂是HRP的自杀性底物,在反应过程中抑制和灭活HRP,制约了酶催化聚合法在实际生产中的应用。目前,人们已经在反应方式上作了许多有益的探索研究,但仍未能从根本上解决这一问题。我们认为从分子水平上改造HRP分子的结构和性能,提高HRP的H₂O₂耐受性,使其适应在非生理条件下催化氧化苯胺类化合物发生聚合反应的要求,是解决这一问题的一条新的有效途径,并将为探索酶催化聚合反应在实际生产中的应用提供科学依据。酶分子定向进化是一种在试管中使酶发生特定结构和功能改变的基因操作技术。酶分子定向进化的基本策略是随机突变,定向筛选。这是一种非常有效且接近于自然进化的酶工程研究新策略。它不仅能使酶进化出非天然特性,而且能使酶进化产生具有多项优化功能,进而发展和丰富酶类资源。20世纪90年代以来,随着易错PCR技术和DNA改组技术的出现,酶分子定向进化技术和策略才日趋成熟和完善。迄今为止,人们已经成功地获得了几十种进化酶,并应用于不同领域,如进化的脂肪酶、蛋白水解酶、纤维素酶等。由此可见,利用酶的定向进化技术可以从分子水平改造天然酶分子的结构和构造新的非天然的酶分子,从而改变酶的活性、稳定性和底物专一性等性能,使其更好地适应体外非生理条件下催化化学反应的要求。目前,有关过氧化物酶进化研究只有少量相关文献报道。1999年Cherry.J.R等研究进化了真菌过氧化物酶,进化的真菌过氧化物酶热稳定性和氧化稳定性分别提高了174倍和100倍。2000年Morawski.B等在大肠杆菌和酿酒酵母中进化了辣根过氧化物酶,进化的辣根过氧化物酶对2,2′-连氨基-2（3-乙基-并噻唑啉-6）铵盐（ABTS）催化活力提高了5.4倍。然而,这些研究成果均以催化氧化小分子化合物（如,ABTS）发生化学反应为进化目标,而以催化氧化合成聚苯胺类导电聚合物为目标的HRP进化研究尚未见报道。我们将分子生物学、组合化学及酶分子体外定向进化的方法和技术应用于聚苯胺类导电聚合物的酶催化合成,以催化苯胺类化合物发生聚合反应为目标进化HRP。从分子水平上,改造HRP的结构和性能,提高HRP在催化苯胺类化合物聚合反应过程中的H₂O₂耐受性,并利用毕赤酵母分泌表达进化HRP,研究进化HRP催化苯胺类化合物发生聚合反应的性质、动力学及聚合物的性能,为HRP催化苯胺类化合物聚合反应在实际生产中的应用奠定基础。二、研究内容及结果1.从辣根（Armorscia rusticana）中克隆了HRPC3基因（hrp）并对其进行了分析检测。HRP基因是真核生物基因,为此,首先从辣根侧根中提取获得了辣根总RNA,琼脂糖凝胶电泳及紫外检测证明提取的辣根总RNA符合要求。而后采用RT-PCR技术获得辣根总mRNA的cDNA,最后利用设计的HRPC3基因特征引物通过PCR扩增技术获得HRPC3基因。经琼脂糖凝胶电泳检测获得的DNA片段大小约为1Kb,与预期结果一致。采用重叠延伸剪切PCR技术,使hrp发生同义突变,获得了删除EcoRI酶切位点的突变hrp。而后,采用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切法,将目的基因（hrp）连接到了pPICZα-A质粒中,成功地构建了PICZα-A-hrp质粒;最后,采用化学方法使融合质粒pPICZα-A-hrp成功地转化了E.coli TOP10。酶切法分析结果及测序分析结果表明克隆到了hrp基因,克隆的hrp基因与NCBA基因库中编号gi:217933的hrp序列比对,其同源性达99.9%。2.利用Invitrogen Corporation提供的Pichia pastoriS表达系统,采用电转化方法转化了Pichia pastorisGS115,并在Pichia pastoris GS115宿主细胞中成功地分泌型表达了hrp,获得了具有生物活性的HRP。Pichia pastoriS表达系统能够在甲醇诱导下高水平、分泌型表达辣根过氧化物酶。Pichia pastoriS表达系统以AOX1基因启动子为外源蛋白质表达的启动子,hrp整合到了Pichia pastoris宿主细胞的AOX1中,整合的pPICZα-A-hrp表达质粒载体的α-引导序列在合成的HRP的N-末端编码α-引导肽,hrp随宿主细胞AOX1基因的表达而高水平表达。实验结果显示,hrp与分泌引导序列被正确地融合,表达的HRP分泌到了Pichia pastoris GS115宿主细胞外。3.HRP催化苯胺类单体聚合反应是在H₂O₂作为氧化性底物存在下进行的。H₂O₂是HRP的自杀性底物,在反应过程中抑制HRP活性或使HRP变性失活。利用易错PCR技术（Error-prone PCR）和交错延伸重组技术（StEP）构建hrp突变文库,在Pichia pastoris表达系统中定向进化HRP,获得了进化HRP17-32。第一轮进化,采用易错PCR技术构建了hrp突变基因文库。筛选并获得了三株可表达H₂O₂耐受性HRP的突变菌株HRP3-46、HRP2-32和HRP3-17。在第二轮进化中,采用了StEP技术,利用第一轮进化获得的三个突变子的hrp为模板,构建了hrp突变基因文库,筛选并获得了可表达具有较高H₂O₂耐受性HRP的突变菌株HRP17-32。采用电转化法转化Pichiapastoris酵母细胞,构建表达文库大大提高了转化的效率,尽可能地满足了构建高库容量突变文库的需求。获得的进化HRP17-32,经H₂O₂处理后,残留活性为638.9 U/l,为未突变野生型HRP的14.7倍（T₂=14.7,T₂=0.81）。HRP17-32对H₂O₂耐受性远远高于未突变野生型HRP,而其催化效率并未降低。突变表型检测结果显示获得的可分泌表达HRP17-32的突变子HRP17-32的突变表型为Mut⁺,可在甲醇诱导下分泌表达进化HRP17-32,表达水平为0.9mg/l。发酵液中进化HRP17-32催化氧化ABTS的活性达到745 U/l,是野生型HRP活性的2.7倍,进化HRP17-32的活性表达水平明显提高。进化HRP17-32催化对苯二胺聚合反应结果显示:在H₂O₂存在下,进化HRP17-32可在非水相溶剂中催化氧化对苯二胺发生聚合反应,反应产率为82%;而未突变的野生型HRP催化的反应产率为58%。4.对重组的突变菌株HRP17-32的发酵和产酶条件及HRP17-32的分离纯化进行了初步的探讨。在甲醇诱导卞,重组的突变菌株HRP17-32可分泌型表达HRP17-32。当甲醇浓度为0.75ml/L、pH6.0、发酵48小时后毕赤酵母HRP17-32突变菌株细胞生长和产HRP17-32活性达到最佳。从发酵液中,分离纯化了进化HRP17-32。HRP17-32的总纯化倍数为72.9,总收率为62.7%,分子量在66.2-116.0 kDa范围内。提取和纯化过程中,酶的纯度提高、收率降低。EndoD内切酶去糖基化分析结果显示,HRP17-32在PichiapastoriS GS/115中表达过程中被不同程度的糖基化。5.探讨了进化HRP17-32催化氧化合成聚对苯二胺及其部分性质,对合成的聚对苯二胺进行了表征。主要研究内容包括HRP17-32催化氧化对苯二胺的反应动力学、HRP17-32的稳定性、聚对苯二胺的结构表征。进化HRP17-32催化氧化对苯二胺的最适温度为45-55℃,最适pH值为6.0,最适H₂O₂浓度约为2.5 mM,酶催化反应的Vmax为11.51×10^-2mmol·min^-1·mg^-1,Km为0.76mM。进化HRP17-32经较高浓度H₂O₂处理后,其残留活性远远高于野生型HRP。进化HRP17-32的酸碱稳定范围为pH 5.6-7.0;在反应温度低于40℃时HRP17-32具有良好的热稳定性;当1,4-二氧六环浓度小于20%HRP17-32较稳定。与野生型HRP相比,HRP17--32的H₂O₂耐受性明显提高,酸碱稳定性、热稳定性以及在有机溶剂中的稳定性并没有降低。UV-ViS光谱、FT-IR吸收光谱、X-射线光电子能谱（XPS）对合成的聚合物的表征结果显示合成的聚合物为苯环1,4-取代型聚对苯二胺,分子量为1528（Mw）,分子量分布系数为1.012。研究结果证实了HRP17-32可以催化氧化合成聚苯胺类化合物。6.利用进化HRP17-32催化氧化对苯二胺和丙烯酸发生聚合反应,合成了水溶性聚对苯二胺-丙烯酸,考察了影响酶催化聚合反应的几个重要因素。聚合反应的最适H₂O₂浓度为0.05%,最适pH值为6.0,丙烯酸与对苯二胺的最适比例为1:1,聚合反应进行24小时时,聚合反应产率达到最高。合成的聚对苯二胺-丙烯酸具有良好的水溶性。利用FT-IR光谱、UV-ViS光谱、X-射线光电子能谱（XPS）、循环伏安法（CyclicVoltammeter）、热重分析等方法,表征了合成的聚对苯二胺-丙烯酸的结构和性能。结果显示,HRP17-32催化对苯二胺和丙烯酸发生聚合反应,合成的聚合物为对苯二胺和丙烯酸的共聚物或更为复杂结构的聚合物。其主要聚合方式为1,4-取代型对位聚合,聚合物结构中含有羧基（-COOH）,聚合物具有较高的热稳定性（热降解温度为589℃）,循环伏安法分析结果显示合成的聚对苯二胺-丙烯酸为具有电活性的聚合物。三、创新性1.应用组合化学、分子生物学及分子进化的方法和技术,在体外定向进化HRP,改造HRP分子的结构和性能,并应用于酶催化聚合反应,目前尚未见文献报道。本文首次探讨了酶定向进化技术在酶催化聚合反应领域的应用。2.首次以酶催化合成聚苯胺类导电聚合物为目标定向进化HRP,提高了HRP的H₂O₂耐受性。获得了具有较高H₂O₂耐受性的进化HRP17-32,以及可分泌表达进化HRP17-32的突变菌株。3.利用RT-PCR技术,从辣根中克隆了HRPC3基因（hrpC3）。研究了hrpc3在Pichia pastoriS GS/115中的功能表达。首次在Pichia pastoriS GS/11中分泌型表达了进化HRP17-32。4.首次利用获得的进化HRP17-32催化氧化对苯二胺以及对苯二胺与丙烯酸发生聚合反应,合成了聚对苯二胺和聚对苯二胺-丙烯酸。研究了HRP17-32催化氧化对苯二胺的动力学性质及酶的稳定性;研究了影响HRP17-32催化氧化对苯二胺与丙烯酸发生聚合反应的几个主要因素以及酶的稳定性,并对合成的聚合物进行了表征。