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α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循环中重要代谢中间产物,作为细胞内碳氮代谢中间点,参与多种细胞代谢活动。α-酮戊二酸被细胞代谢后,能为细胞提供ATP。因此作为能量补充剂,在食品、医药等行业具有广泛的应用范围。利用微生物发酵法合成α-酮戊二酸的主要缺点是生产性能有待提高。在众多发现的能积累α-酮戊二酸微生物中,解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)因底物范围宽和能积累多种有机酸,被认为是生产α-酮戊二酸最优势菌株。目前,该酵母产酸机制不明确和积累大量的代谢副产物丙酮酸制约其大规模工业生产。本论文应用比较基因组和蛋白组学对该酵母积累α-酮戊二酸机制进行了探究,并在该基础上提出代谢工程改造策略强化α-酮戊二酸的生产及降低代谢副产物丙酮酸含量。主要研究结果如下:(1)采用Illumina Mi Seq高通量测序技术和Pac Bio RS高通量测序技术对α-KG高产菌株Y.lipolytica WSH-Z06进行了全基因组测序,获得了大小为20.14 Mbp包括6条染色体和1条环状线粒体的基因组序列。通过对比分析Y.lipolytica WSH-Z06菌株与Y.lipolytica CLIB122菌株的α-KG合成相关途径,发现了10条对α-KG合成有帮助的基因发生了拷贝数的变化。相对于Y.lipolytica CLIB122菌株,Y.lipolytica WSH-Z06菌株具有缺失甘油三脂合成途径中酶编码基因和增加异柠檬酸脱氢酶拷贝数的α-KG合成基因组特异性。这一研究不仅从基因组层面揭示了α-KG高产菌株Y.lipolytica WSH-Z06合成α-KG的特异性,而且为后续研究提供清晰的遗传信息。(2)基于Y.lipolytica WSH-Z06全基因组测序结果,从其基因组范围内筛选出YALI0B19470p、YALI0C15488p、YALI0C21406p、YALI0D24607p、YALI0D20108p和YALI0E32901p可能的酮酸转运蛋白,并在酮酸转运功能缺失的Saccharomyces.cerevisiae细胞中验证其多功能的转运功能。过量表达YALI0B19470p的重组菌株细胞外积累的α-KG从36.6 g L-1上升至46.7 g·L-1,而胞外的丙酮酸含量从17.8 g·L-1降低至12.3 g·L-1,强化了α-KG在细胞外的积累。从酮酸转运的机制角度表明,细胞同时编码6条能以多种羧酸为底物的酮酸转运蛋白是Y.lipolytica WSH-Z06菌株能同时积累多种有机酸的原因之一。(3)通过基于双向电泳的比较蛋白组学研究揭示了在发酵生产α-KG过程中降低培养环境中的p H值能促进α-KG的过量积累。在低环境p H条件下,细胞为维持细胞内环境的相对恒定,通过提高两个H+-转运ATPases的表达强化将胞浆中H+转运出细胞。同时,细胞提高电子传递链上4个组分的表达量将线粒体内的H+通过电子链传递给活性氧形成H2O并加快ATP的生成。为回补细胞内加速消耗的ATP和NADH/NADPH等高能化合物,细胞通过提高糖异生途径中的7个蛋白和三羧酸循环中7个蛋白的表达量,强化对底物甘油和丙酮酸分解利用为细胞提供能量。这一过程中,细胞内的天冬氨酸转氨酶表达量下降和酮戊二酸脱氢酶活力降低将增大的细胞内碳代谢流截留在α-KG节点,导致了细胞内积累的α-KG增加。(4)基于比较基因组和比较蛋白学研究结果,提高细胞内乙酰-Co A的含量是影响α-KG积累的关键因素。为了增加细胞内乙酰-Co A含量,考察在Y.lipolytica WSH-Z06中单一过量表达丙酮酸脱氢酶的各组分的编码基因PDA1、PDB1、LAT1和LPD1对α-KG积累影响。单一过量表达PDA1提高了乙酰-Co A含量,并导致合成α-KG的关键基因CIT1、CIT2、ACO2、IDP1、IDH1和IDH2表达水平升高,增大丙酮酸流向α-KG的碳代谢通量。在3-L发酵罐发酵试验中,Y.lipolytica S1菌株细胞生长速度和发酵液中菌体干重都优于野生型菌株,经过144 h发酵,发酵液中的α-KG提高了19.9%,至43.3 g·L-1,丙酮酸含量从34.2 g·L-1降低至20.1 g·L-1。(5)通过表达酮戊二酸脱氢酶E2组分,验证了单一过量表达该组分能降低细胞内酮戊二酸脱氢酶总催化活力促进α-KG的积累的生理调控机制。为降低α-KG经三羧酸循环分解代谢,考察E2组分活性保守His419残基和Asp423残基突变对酮戊二酸脱氢酶催化活力影响。单一表达Asp423残基突变成谷氨酸残基的M6最有利于菌体积累α-KG,此时α-KG含量增长了37.7%,至19.9 g·L-1。在随后的3-L发酵罐中小试实验表明,M6菌株细胞外积累的α-KG含量为50.4 g·L-1,是野生菌株139.7%。在体外测定酶突变体表明Asp423残基同时参与了酶催化和底物结合。