研究背景Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种X连锁隐性遗传的致死性肌肉病,发病率为1/3500存活男婴,由位于Xp21的dystrophin基因突变引起的骨骼肌肌膜上dystrophin蛋白表达缺失或严重减少而致病。临床表现为肢体近端对称性、进行性无力,疾病晚期累及膈肌、心肌,般3-5岁起病,9-13岁不能行走,15～25岁死亡,多死于心肺功能衰竭。肌肉病理改变以肌纤维坏死、再生,高收缩纤维,劈裂纤维,肌内膜增生及脂肪组织浸润为主要表现。目前对本病无有效治疗手段。虽然对dystrophin蛋白的研究已有20余年,产生了机械损伤假说、钙稳态失衡假说、血管舒张功能障碍、氧化应激、信号通路异常、炎症反应等DMD发病机制假说,但是dystrophin蛋白的缺失导致肌纤维的变性、坏死的始动因素目前仍不十分清楚。有研究发现静息的离体DMD细胞内Ca2+并无明显升高,收缩后的DMD细胞内Ca2+则显著高于正常对照细胞,提示肌肉收缩是DMD细胞Ca2+调节异常的重要因素。神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)基因敲除小鼠并未发生肌肉的病理改变和肌力下降,这提示我们nNOS在DMD的发病机制中可能并不是直接发挥作用,而是通过增加损伤的程度影响DMD病程。因此,钙稳态失衡假说和血管舒张功能障碍假说可能仅解释了DMD发病中的某些下游机制。Ozawa认为,dystrophin蛋白作为细胞骨架的一部分,除发挥一定的机械作用外,不具有任何生物化学功能,我们认为DMD患者肌纤维坏死的始动因素可能与dystrophin蛋白的机械作用有关。Ozawa等人提出,dystrophin蛋白与sarcoglycan (SG)和dystroglycan (DG)等dystrophin相关蛋白共同作用组成了一个单体模型—dystrophin bolt。 Dystrophin的C端与β-dystroglycan紧密相连而将dystrophin蛋白牢固的固定在肌膜上,同时,dystrophin蛋白的另一端(N端)与肌膜下细胞骨架的F-actin相连；此外,α-dystroglycan还与基底膜蛋白laminin-α2相连。这样dystrophin就将肌膜下细胞骨架与肌膜、基底膜连在一起,作为细胞骨架与肌膜、基底膜之间的脚手架,同时也成为细胞骨架的一个组成成分。另外,dystrophin bolt也是肌原纤维的Z线与基底膜之间联系的脚手架。结蛋白-波形蛋白中间丝(desmin-vimentin intermediate filaments, DVIF)分布在每一条肌原纤维的Z线部位,将不同的肌原纤维包裹成一个肌原纤维束,然后,DVIF呈放射状与肌膜下细胞骨架的肋节处的dystrophin bolt相连,这一结构称为横向固定系统(transverse fixation system, TFS)。此横向固定系统对维持肌小节和肌膜的稳定性有重要作用。目前,多数学者均同意dystrophin蛋白具有保护肌膜完整性的作用这一观点,并且这一膜保护作用在肌肉收缩过程中尤为重要。我们发现,DMD患者的肌肉损伤与肌肉收缩和收缩方式有密切的关系：①DMD患儿血CK水平随其运动的增多而增高于新生儿期其血CK水平开始升高,随着年龄的增长、活动量的增多而越来越高,一般3岁左右达到高峰,升高幅度最大可达正常值的100倍以上,然后逐渐下降,每年下降约20%。从短期来看DMD患儿的肌肉破坏也可以随着运动的增多而出现短暂的波动。Florence等人研究发现DMD患者即便是在血CK水平很高的情况下去逛动物园,也能使其CK增高10倍以上,表明运动是患者血CK水平增高的关键因素。②DMD患儿的肌无力随其运动的增多而加重几乎所有的DMD患儿均经历一个共同的临床病程：患儿的运动发育一般没有明显的延迟,多于18个月前能独立行走,但其跑、跳等能力较同龄儿差,除此之外,大部分患儿3岁之前没有明显的肌无力症状。随着患儿独立活动的增多,自3岁之后开始出现明显的蹲起费力、上楼困难等下肢带肌无力的症状,此后患儿的症状进展较慢,7-9岁后其运动能力直线下降,13岁前几乎所有的患儿均需轮椅或卧床。可见患儿运动能力的损害也是随着运动的增多而逐渐加重的。③大量高收缩纤维DMD患者的另一个较特异性的病理改变就是大量的高收缩纤维,这类纤维的数量约占肌纤维总数的4.3-8.3%。目前认为肌肉收缩导致肌膜、肌小节被拉断是高收缩纤维形成的始动因素。我们通过电刺激mdx小鼠(DMD的模型小鼠,肌纤维完全不表达dystrophin蛋白)的离体趾长伸肌(extensor digitorum longus, EDL)使其收缩,结果产生了大量的高收缩纤维。④2B型纤维更易受累DMD患者的2B型纤维更易受累,2B型纤维自2岁时开始减少,5岁时完全缺失,Henning等人认为：2B型纤维的受到快速、有力的收缩而产生的高强度的机械应力导致肌膜受损,进而引起肌纤维的坏死。⑤眼外肌和喉内肌终生不受累虽然DMD患者的骨骼肌广泛受累,但是,眼外肌(extraocular muscle, EOM)和喉内肌(intrinsic laryngeal muscle, ILM)去却终生不出现肌无力的症状和病理改变。DMD患者EOM和ILM不受累的原因已引起了广泛的关注,尽管已经发现了EOM(或ILM)有较高的钙稳态维持能力、自由基清除能力和再生能力,但是,尚无直接证据表明EOM的这些特性是其不受累的原因。我们通过分析EOM和ILM的运动方式发现,这两种肌肉几乎只做缩短收缩,终生不做拉长收缩和等长收缩,而DMD患者早期受累且受累最为严重的髂腰肌、股四头肌和臀部肌肉在婴儿期就已经开始做拉长收缩和等长收缩,并且在日常生活中频繁进行此二种方式的收缩。因此,我们认为拉长收缩和等长收缩是DMD患儿肌肉破坏的重要原因,而缩短收缩对肌肉没有明显的损害。目前国内外尚无研究直接证明运动与dystrophin蛋白缺失肌纤维坏死的关系,也无研究对比分析不同的肌肉收缩方式对dystrophin蛋白缺失肌纤维的损害程度。研究目的：1.探讨运动本身与dystrophin蛋白缺失肌纤维损伤的关系。2.设计体外对比不同收缩方式致肌纤维损伤的实验仪器及实验方案。3.对比不同肌肉收缩方式对dystrophin蛋白缺失肌纤维的损伤程度。研究方法：1.过度运动对mdx小鼠小腿三头肌(triceps surae muscle, TS)损伤的研究。将6只5周龄的mdx小鼠(带有dystrophin基因突变的DMD模型小鼠)随机分为2组：正常饲养组和过度运动组。另将6只5周龄的C57BL/6小鼠(正常小鼠)随机分为以上两组作为对照。过度运动组小鼠每天在超净台中进行中等强度的运动1次,即在转笼中跑动30min,然后放回屏障系统内的饲养笼中正常饲养。正常饲养组小鼠始终置于屏障系统内正常饲养。实验第13天给每只小鼠腹腔注射伊文思蓝(evans blue dye, EBD)溶液,注射剂量为100μl/10g体重。注射后第二天苯巴比妥钠麻醉致死小鼠,取双侧TS,称其湿重,冰冻。在每条TS的中间部位开始连续切片2张,一张HE (hematoxylin-eosin)染色,计数其肌纤维的总数、坏死／再生纤维、中央核纤维、高收缩纤维的数量；另一张于荧光纤维镜下计数EBD阳性肌纤维的数量。计算各种病变肌纤维的比例,统计分析运动对C57BL/6小鼠和mdx小鼠TS肌纤维损伤的差异。2.不同收缩方式对mdx小鼠离体EDL损伤的研究。将9只12周龄mdx和C57BL/6小鼠的EDL分别分为：拉长收缩组(lengthening contractions,LC)、等长收缩组(isometric contractions, IC)、缩短收缩组(shortening contractions, SC),每组n=6。肌肉置于“体外拉伸-电刺激”设备中,模拟相应的肌肉收缩,每条肌肉收缩2次,以避免疲劳。肌肉收缩前和收缩后1分钟分别测其最大强直收缩力(maximum tetanic isometric force, Po),并计算肌力下降率=(Po前-Po后)／P。前×100%。然后,将肌肉浸泡于普施安橙(procion orange dye, POD)溶液中,90min后取出,Ringer液洗2x5min,滤纸吸干表面液体,称重,OCT (optimum cutting temperature)包埋剂包埋、冰冻。从肌肉的中间部分开始切片2张,一张用于HE染色,光镜下计数肌纤维总数,另一张于荧光显微镜下计数POD阳性肌纤维数量,计算肌肉的POD阳性肌纤维比例。3.单纯缩短收缩对mdx小鼠体内小腿三头肌损伤的研究。将2组鼠龄分别为21天(n=6)和30天(n=6)的mdx小鼠于超净台中随机选择某侧跟腱,行跟腱切断术,对侧跟腱保留,然后置于屏障系统内饲养14天。跟腱切断侧的TS只能做无阻力的缩短收缩,而对侧跟腱保留的TS可做三种不同形式的收缩。另将2组鼠龄相匹配的C57BL/6小鼠行相同的处理作为对照。于实验第13天给每只小鼠腹腔注射EBD溶液,注射剂量为100μl/10g体重,注射后第二天苯巴比妥钠麻醉致死小鼠,取其双侧的TS,称湿重,冰冻。于肌肉的中间部分开始连续切片2张,一张行HE染色,光镜下计数其肌纤维的总数、坏死／再生纤维、中央核纤维、高收缩纤维的数量；另一张于荧光纤维镜下计数EBD阳性肌纤维的数量。计算各种病变肌纤维的比例,比较mdx小鼠跟腱切断侧与保留侧TS肌纤维损伤的差异。研究结果：1.过度运动对mdx小鼠小腿三头肌损伤的研究。过度运动对mdx小鼠和C57BL/6小鼠TS的湿重没有明显的影响(P值分别为0.226和0.567,n=6)。过度运动对mdx和C57BL/6小鼠TS肌纤维的总数没有明显的影响(P值分别为0.354和0.377,n=6)。与正常饲养组mdx小鼠相比,过度运动组mdx小鼠TS的坏死／再生、中央核、高收缩、EBD阳性纤维比例明显升高(P值均<0.01,n=6)。2.不同收缩方式对mdx小鼠离体EDL损伤的研究。对于C57BL/6小鼠,LC组产生的肌力下降率最大,损伤最大(P值均<0.01)；IC组和SC组相比,两组的肌力下降率无统计学差异(P=0.55)。对于mdx小鼠LC组产生的肌力下降率最大、IC组居中、SC组最小,两两比较均有显著性差异(P值均<0.01)。LC和IC对mdx小鼠EDL的损伤明显大于C57BL/6小鼠(P值均<0.01),SC对两种小鼠EDL的损伤无显著差异(P=0.92)。对于C57BL/6小鼠,LC组的POD阳性纤维比例明显高于IC组和SC组(P值均<0.01)；IC组和SC组之间无统计学差异(P=0.99),表明LC对正常小鼠的肌膜损伤大于IC和SC, IC和SC对正常小鼠肌膜的损伤没有差异。对于mdx小鼠,LC组、IC组和SC组的POD阳性纤维比例依次下降,两两比较均有统计学差异(P值均<0.01)。LC和IC对mdx小鼠肌膜的损伤程度大于C57BL/6小鼠(P值均<0.01)。SC对mdx小鼠和C57BL/6小鼠的肌膜损伤程度无统计学差异(P=0.82)。3.单纯缩短收缩对mdx出小鼠体内小腿三头肌损伤的研究。鼠龄为21天和30天的两组C57BL/6小鼠单侧跟腱切断并饲养14天后,跟腱切断侧的TS和跟腱完整侧的TS相比,其肌肉湿重均明显减轻(P<0.01),肌纤维总数无显著性差异(P值分别为0.29和0.31),HE染色均未见坏死／再生、中央核及高收缩纤维,荧光显微镜下未观察到EBD阳性肌纤维。表明跟腱切断术除能导致TS肌肉萎缩外不会产生肌纤维坏死和肌膜破坏两组mdx小鼠单侧跟腱切断并饲养14天后也出现与对照组相同的肌肉萎缩。此外,两组mdx小鼠的双侧TS均出现了病理性改变,跟腱切断侧TS的坏死／再生、中央核、高收缩、EBD阳性纤维比例均明显低于跟腱完整侧肌肉(P值均<0.01)。结论1.运动本身能直接导致mdx小鼠肌纤维肌膜的损伤和肌纤维坏死。2.不同收缩方式对mdx小鼠肌肉的损伤程度不同,拉长收缩和等长收缩分别导致严重和中度的损伤,且损伤程度较正常肌肉明显加重；无阻力的缩短收缩对mdx小鼠肌肉仅产生极轻微的损伤,且损伤程度与正常肌肉没有显著性差异。3.本研究设计的“不同收缩方式对mdx小鼠离体EDL损伤的实验方案”灵敏、客观、可行、组间可比性好、区分性好,可以用于所有评估不同收缩方式对正常和／或异常肌肉的影响的研究。4.本研究为鼓励DMD患者行无阻力的缩短收缩和避免拉长、等长收缩提供了实验依据,对患者的日常生活和康复治疗有积极的指导意义。