传统的灭活疫苗是预防动物疫病的重要手段之一。然而,由于灭活疫苗在制备过程中的抗原决定簇可能被物理或化学(福尔马林)处理而破坏或部分被破坏,导致保护效率低或能起到保护但动物是该病原菌的携带者；此外,由于疫苗是灭活的全细胞,存在将耐药基因和毒素编码基因带入被接种动物的风险。因此,研究保留天然抗原结构并消除耐药性和致病性风险具有重要的理论和应用意义。我们采用基因工程手段,以猪的支气管败血波氏杆菌和大肠杆DH5α为研究对象,构建了含噬菌体PhiX174的裂解E基因和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)重组质粒,使金黄色葡萄球菌核酸酶A可在IPTG的诱导下表达,裂解蛋白E可在温控诱导下表达。将构建的质粒转入大肠杆DH5a和支气管败血波氏杆菌,从而试图去除细胞质和耐药基因以及水解DNA保留天然抗原。结果如下：1.为了提高细菌幽灵的安全水平,将含噬菌体PhiX174的裂解E基因盒和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因一起插入质粒,构建了含氨苄青霉素抗性基因的质粒pGEX-4T-1-S-E和含卡那霉素抗性基因的融合表达质粒pET29a-S1-E、非融合表达质粒pET29a-S2-E,通过单酶切和琼脂糖电泳鉴定表明,质粒pGEX-4T-1-S-E为6822bp,融合表达质粒pET29a-S1-E为7211bp,非融合表达质粒pET29a-S2-E为7106bp,所构建的这三种质粒大小都与理论值相符合；对SN基因和含噬菌体phiX174的裂解E基因盒进行测序鉴定,SN基因所测得基因序列与GenBank中MRSA252菌株的SN基因完全相同,E盒所测得基因序列与理论序列完全相同；证明这三种质粒都构建成功。2.将重组质粒pGEX-4T-1-S-E转入大肠杆菌DH5α并诱导表达,检测菌体及上清液中所含的DNA,结果显示大部分DNA被降解成100bp左右；用CFU检测,大肠杆菌DH5α的裂解致死率最高达99.999%,成功地制备了大肠杆菌DH5α细菌幽灵。3.猪的支气管败血波氏杆菌的药敏实验,从药敏试纸的抑制圈大小结果表明,支气管败血波氏败血杆菌对氨苄青霉素,庆大霉素有耐药性,而对氯霉素,四环素,卡那霉素很敏感。因此选择含有抗卡那霉素的质粒在支气管败血波氏杆菌中表达。4.在大肠杆菌中表达成功的基础上,将含有抗卡那霉素的融合表达质粒pET29a-S1-E与非融合表达质粒pET29a-S2-E分别转入支气管败血波氏杆菌中并诱导表达,检测菌体及上清液中所含的DNA,结果显示大部分DNA被降解成100bp大小；用CFU检测,含质粒pET29a-S1-E的支气管败血波氏杆菌的裂解致死率最高达99.994%,含质粒pET29a-S2-E的支气管败血波氏杆菌的裂解致死率最高达99.993%,实现了支气管败血波氏杆菌的遗传灭活。在裂解致死率上,非融合质粒和融合质粒表达效果差别不大。